Главная страница Случайная страница
КАТЕГОРИИ:
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Хід роботи. Для проведення роботи використовують прототрофний гаплоїдний штам
|
|
Для проведення роботи використовують прототрофний гаплоїдний штам
дріжджів S. cerevisiae 15В-П4 (рис. 3). Опромінення УФ-променями проводять
бактерицидною лампою БУВ-30П при інтенсивності випромінювання 20 ерг/мм2 ∙ с. Тривалість експозиції становить 60, 90 і 120 с (загальна доза дорівнює відповідно 1200, 1800, 2400 ерг/мм2).
Відстань між джерелом УФ-променів і поверхнею чашки – не більше 35 см. Опроміненню піддають моноклітинну культуру з концентрацією 5∙ 106 клітин/мл. Опромінення проводять у чашках діаметром 40 – 50 мм (під час опромінення кришку знімають). Оброблення опроміненої суспензії, розсів її на чашки, загортання чашок у папір слід проводити при червоному світлі, яке перешкоджає фотореактивації опромінених клітин.
1. Із приготовленої суспензії концентрацією 5•106 клітин/мл (методику приготування див. у лабораторній роботі 1) відбирають 0, 1 мл для контрольного висіву на чашки. При цьому розводять суспензію до концентрації 1∙ 104 клітин/мл внесенням 0, 1 мл суспензії в 4, 9 мл води (розведення І). Із розведення І 0, 1 мл суспензії додають до 0, 9 мл води (розведення ІІ).
2. На чашку з попередньо залитим середовищем повного складу вносять по 0, 05 мл суспензії з кожного розведення, після чого суспензію розтирають шпателем. Потім чашки вміщують у термостат з температурою 30 °С. Контрольний висів дає можливість визначити густину висіву вихідної суспензії, частоту появи спонтанних аденинзалежних мутантів і служить контролем для порівняння з результатами опромінення клітин.
3. Перший варіант. Під час опромінення суспензії клітин перенесена
в чашки культура постійно перемішується легким погойдуванням (без розбризкування!). Після закінчення експозиції чашку закривають, виводять із опромінення й відбирають із суспензії пробу в кількості 0, 1 мл. Переносять її у пробірку з 2, 4 мл води для одержання розведення І. З розведення І відбирають 0, 1 мл суспензії й переносять в 0, 1 мл води (розведення ІІ). У такий спосіб аналізують кожну дозу опромінення.
Другий варіант. Після відбору проби із суспензії, опроміненої мінімальною дозою, чашку знову поміщають під випромінювач, і експозиція щораз подовжується відповідно на 600 ерг/мм2 ∙ с). Сумарно клітини отримають дозу 2400 ерг/мм2. Відбір проб для аналізу на ефективність дії УФ-променів здійснюють за послідовністю наведеною в табл. 3.
Всі засіяні чашки загортають у папір і вміщують у термостат з температурою 30 °С на 6 – 7 діб, після чого опрацьовують результати, які після статистичного опрацювання заносять у табл. 4.
Статистичне опрацювання результатів індукованого мутагенезу. Для
статистичного опрацювання результатів, отриманих під час опромінювання чи
дії мутагенів, досліди необхідно кілька разів повторити.
З кожного варіанта дослідів відбирають чашки з типовими колоніями для контролю і для кожної дози мутагену й підраховують кількість вирослих колоній (сумарно).
Обчислюють відсоток виживаємості при кожній дозі мутагену для даного %. Приклад. Позначимо число колоній, що виросли на трьох чашках у
контролі, N, а число колоній, що виросли на трьох чашках при даній дозі – n.
Для контрольних чашок здійснюють розведення вихідної суспензії в 500 разів, а опроміненої суспензії – лише в 250 разів, тобто кількість клітин, що потрапили на кожну чашку після опромінення, буде в два рази більшою. Позначимо
коефіцієнт розведення контролю буквою k. Прийнявши виживаємість клітин за
100 %, отримаємо виживаємість при тій або іншій дозі, 100% досліду з огляду на вихідні розведення для висівів; виживаємість у контролі приймають за 100
або для першої дози
Аналогічно розраховуємо виживаємість і для інших доз мутагену. Отримані дані з виживаємості зводять у табл. 4 з урахуванням доз і кількості повторених дослідів, попередньо прологарифмувавши кожну величину виживаємості
На міліметровому папері будують графік залежності виживаємості опромінених клітин від дози УФ-променів. На осі абсцис відкладають значення використаних у досліді доз мутагенів (в ергах на квадратний міліметр або секундах), а по осі ординат – середні логарифми виживаємості. На графіку вгору й униз від крапок, що відповідають середнім значенням виживаємості для кожної із доз, відкладають довірчі інтервали, що показують розмах варіювання результатів у повторних дослідах.
Уважно розглядають вирослі на чашках колонії. Позначають тушшю всі мутантні клони, підраховують їхню кількість і записують у таблицю, складену за таким зразком:
мутагену
Доза
Кількість переглянутих
чашок
Середня кількість
колоній на чашці
Загальна кількість переглянутих
клонів
Кількість мутантних
клонів
Частота мутацій аденозин-
залежності
Контроль
І
ІІ
ІІІ
Середню кількість колоній на чашці визначають підрахунком колоній на чашках, засіяних для обліку виживаності. Частоту індукованих мутацій для кожної дози визначають за формулою
,
де М – кількість мутантних клонів; N – кількість колоній на переглянутих
чашках.
Частота появи спонтанних аденозинзалежних мутантів при такій вибірці близька до нуля.
Всі дані з частоти індукованих мутацій за винятком спонтанного фону зводять у таблицю за повторними дослідами, як це було зроблено під час обліку виживаності.
За отриманими даними будують графік залежності виживаності клітин від дози мутагену та криву доза – ефект для частоти індукованих мутацій аденозинзалежності.
Контрольні запитання
1. Яка роль мутагенів у природі й експерименті?
2. Які мутагенні фактори викликають зміни в геномі клітини?
3. Як оцінити дію мутагену?
4. На чому ґрунтується статистичне опрацювання результатів дії
мутагенів? Які основні розрахунки?