Загальні відомості. Термін плазміди був уперше застосований Дж

Термін " плазміди" був уперше застосований Дж. Ледербергом в 1952р. для позначення всіх позахромосомних спадкоємних детермінант. Нині під цим терміном розуміють незалежно реплікуючу позахромосомну ДНК бактерій. Плазміди – звичайні компоненти бактеріальних клітин, але вони також можуть зустрічатись у низчих еукаріот. У більшості випадків плазміди – це суперспіралізовані ковалентно-замкнені кільцеві молекули ДНК довжиною від

2 до 600 тисяч пар нуклеотидів. Завдяки кільцевій структурі плазмідні ДНК не підпадають під вплив екзонуклеаз. Існують також і лінійні плазміди, стійкість яких до дії екзонуклеаз забезпечується білками, що знаходяться на кінцях молекули ДНК.

Клітини, які отримують плазміди, як правило, отримують і нові ознаки. Ці ознаки лягли в основу назв вперше виявлених плазмід, а саме: F-плазмід (фактор статі), які надають клітинам донорних властивостей; Col-плазмід, які сприяють синтезу коліцинів; R-плазмід, що визначать стійкість клітин до антибіотиків.

Плазміди дають клітинам різноманітні фенотипові ознаки, зокрема, стійкість до антибіотиків (ампіциліну, тетрацикліну, хлорамфеніколу та ін.), катіонів (вісмута, кадмія, кобальта, ртуті, свинцю), аніонів (арсенату, арсеніту), мутагенів (акридинів, етидіум-броміду, УФ-хвилям), бактеріоцинів. Отримавши певні плазміди, клітини здатні викликати біодеградацію камфори, ксилолу, нафталіну, n-алканів, толуолу; можуть синтезувати антибіотики, бактеріоцини, гемолізин, інсектециди, пігменти, поверхневі антигени, токсини; використовувати у якості джерела вуглецю різноманітні цукри і незвичні

амінокислоти; здатні кон’югувати з реципієнтними штамами бактерій; можуть індукувати пухлини у рослин4 а також здійснювати рестрикцію і модифікацію ДНК.

Основними біологічними властивостями плазмід є здатність до реплікації, кон’югативність, інтегративність, несумісність, стабільність і фенотипові ознаки, які вони надають бактеріям.

Плазміди відіграють роль своєрідних посередників (векторів) при міжклінному обміні генами. Більшість таких генів, зокрема, гени стійкості до антибіотиків, попадають до плазмід за допомогою транспозонів і інтегронів. Цей процес сприяє швидкій адаптації клітин до факторів завнішнього середовища. Частота таких явищ в природі порівняно невисока. Але на протязі останніх десятиліть вона суттєво виросла у зв’язку з неконтрольованим використанням антибактеріальних препаратів і забрудненням навколишнього середовища промисловими відходами.

Підготовка бактеріальної культури для проведення досліджень. У

дослідженнях важливе значення має вибір бактеріальної культури та її культивування з метою одержання достатньої кількості клітинної біомаси – матеріалу для генетичних досліджень. У зв’язку із цим звертають увагу, по- перше, на склад поживного середовища та на пов'язані з цим проходженням клітинами фаз розвитку, по-друге, на утворення достатньої кількості біомаси, по-третє, на формування клітинних структур, що добре піддаються

генетичному аналізу. Для виділення плазмідної ДНК із клітин E. coli K-12

останні вирощують на багатому поживному при середовищі при температурі 37 °С в умовах слабкої аерації (досягається легким погойдуванням колби). Відношення об’єму середовища до об’єму колби 1: 25. Вирощування проводять протягом 10 – 12 год. Концентрація клітин у середовищі має досягти щільності, що дорівнює 5х10 в 7 ступені клітин/мл (при цьому спостерігається ампліфікація ДНК).

Руйнування клітин для виділення нуклеїнових кислот. Залежно від

того, який мікроорганізм узято для досліджень (грампозитивний або грамнегативний, його таксономічне положення) застосовують три методи руйнування клітин:

1. за допомогою хімічного детергенту;

2. з використанням сумісної дії детергентів і гідролітичних ферментів;

3. за допомогою таких фізичних методів як руйнування під дією

ультразвуку, у результаті різкої зміни тиску або під час струшування зі скляними кульками (діаметром 0, 1 – 0, 7 мм).

Для руйнування клітин з використанням детергентів і виділення ДНК бактеріальну культуру центрифугують при частоті обертання 6000 об/хв протягом 10 хв при температурі 4 °С.

Осад промивають холодним розчином 0, 1 М NaCl, 10 мМ тріс-HCl, 1 мМ ЕДТА, рН 8, 0 і центрифугують при частоті обертання 6000 об/хв протягом 10 хвилин.

Клітини ресуспендують у розчині 50 мМ глюкози, 25 мМ тріс-HCl, 10 мМ ЕДТА, рН 8, 0 з 5 мг/мл лізоциму (кристалічного). До 1 г клітин додають 6 мл цього розчину. Суміш залишають на 10 – 20 хв при кімнатній температурі.

Потім до суміші додають 0, 2 М розчин NaOH, 1, 4 мл 1% розчину ДДС і протягом 10 – 15 хв перемішують вміст склянки.

ДНК можна отримати також по методу Савули й Кроуфорда (Savula R.V.,

Krawford 1972). Методика виділення ДНК складається з таких етапів:

1. клітини донора E. coli K12 вирощують із використанням аерації при

30 – 35 °С до ранньої стаціонарної фази в 10 мл L- бульйону. Аерацію

здійснюють пропусканням бульбашок повітря через середовище в пробірках (пробірки 25 200 мм) через скляні палички діаметром 4 – 5 мм, що виходять через корок пробірки. Палички через гумові трубки приєднують до акваріумного мікрокомпресора, дотримуючись правила подавання стерильного повітря). Або аерують культуру клітин струшуванням на качалці в колбах, занурених у водяну баню;

2. клітини осаджують центрифугуванням при частоті обертання 6000

об/хв 10 хв і ресуспендують у 2, 4 мл сольового буфера з ЕДТА (БР І);

3. додають 100 мкл 6 % розчину ДДС й інкубують суспензію 10 хв

при температурі 37 °С для забезпечення лізису клітин;

4. освітлюють лізат додаванням 50 мкл 5 М КСl і після охолодження

при температурі 0 °С (в льоді) протягом 10 хв центрифугують 20 хв при частоті обертання 10000 об/хв і охолодженні для відділення клітинного дебрису;

5. надосадову рідину, що містить ДНК, нагрівають при температурі

50–60 °С протягом 5 хв для інактивації залишкових ферментів;

6. стерильність лізату перевіряють висівом на чашки з L -агаром і

витримуванням протягом 10 – 12 год при температурі 30 – 39 °С;

7. якщо потрібно, осаджують ДНК додаванням двох об'ємів 96 %

холодного етанолу й намотують її на скляну паличку з гачком на кінці, а потім розчиняють ДНК у ССР;

8. визначають концентрацію ДНК кольоровою пробою з

дифеніламіном, тому що в отриманому препараті можуть міститися РНК й інші домішки, що поглинають в ультрафіолеті;

9. зберігають препарат ДНК у етанолі при температурі 4 °С.