Лекція . Апоптоз в органах клітин шлунково-кишкового тракту.

ВСТУП

Загибель клітин відіграє таку ж важливу роль у функціонуванні організму як і проліферації.

У вищих організмів гомеостатичний контроль кількості клітин є результатом динамічної рівноваги між клітинною проліферацією і клітинною загибеллю.

Чому це так? Відповідь на це питання буде скоріш філософська, оскільки вимагатиме пригадати такі основні категорії як час, швидкість, циклічність функціонуючих систем організму, що забезпечує економічність. Не забуваймо і про потребу у відмиранні тимчасових систем при рості і формуванні організму як з прямим, так і непрямим розвитком.

Еволюційно рано у багатоклітинних організмів (перш за все тваринних) виник генетично запрограмований, чітко скоординований з екзо- і ендогенними сигналами фізіологічний процес руйнування “непотрібних” клітин: тих, що “відпрацювали”, або є “небезпечними” оскільки містять генетичні помилки, чи уражені пошкоджуючими факторами різної природи.

Високоспеціалізовані клітини щоб оптимально ефективно виконувати свою функцію мають тою чи іншою мірою втратити універсальність. Крайній приклад – еритроцити, імунокомпетентні лімфоцити.

Термін “апоптоз” був запропонований Wylli et al. (Ендрю Уілі і співавторами) у 1972році. В перекладі з давньогрецької означає: аpo – відділення + ptosis – падіння і в контексті древнього свого використання це словосполучення може тлумачитись як “опадання листя”.

Концепція про те, що розвиток патологічних процесів в організмі зумовлений масовою катастрофічною загибеллю окремих його клітин склалася ще в ХІХ столітті завдяки роботам видатного німецького вченого Рудольфа Вірхова. Зміна акцентів щодо патогенетичної ролі втрати рівноваги між утворенням і загибеллю клітин відбулася, зокрема, із відкриттям американськими вченими Стенлі Корсмейєром і Робертом Горвіцем “генів смерті” у кінці ХХ століття.

Таким чином, апоптоз є необхідним для підтримання гомеостазу (постійності клітинного складу) і комплементарний діленню клітин (проліферативним процесам).

2.МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ ПРИ АПОПТОЗІ.

Апопотоз характеризується паралельними морфологічними і біохімічними змінами в клітинах. Морфологічні зміни:

1. Індукторний проапоптичний сигнал (активація апоптозу)

буває різної природи. Залежно від природи стимулу і від типу клітини необхідна різна інтенсивність і тривалість дії проапоптичного фактора для розвитку апоптозу.

2. Конденсація хроматину в ядрі біля ядерної оболонки.

Далі йде розпад ядра на дискретні фрагменти оточені мембраною.

3. Конденсація цитоплазми: розрив цитоскелету апоптичної клітини, руйнування міжклітинних контактів (таким чином апоптизуюча клітина ізолюється від сусідніх клітин). На поверхніапоптичних клітин утворюються структури (пухирці) важливі для розпізнавання сусідніми клітинами і макрофагами.

4. Фрагментація апоптизуючої клітини до невеликих оточених мембранами “апоптичних тілець” які містять частини фрагментованого ядра, органели, частини цитоплазми.

5. Фагоцитоз і деградація сусідніми клітинами і тканинними макрофагами апоптичних тілець за участю лізосомальних ферментів фагоцитуючих клітин.

3. БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ І ГЕНЕТИЧНА ПРОГРАМА АПОПТОЗУ.

Апоптоз є генетично запрограмованим і енергозалежним процесом. При експериментальному пригніченні експресії генів, біосинтезу білку та утворення АТФ (роботи мітохондрій) індуктори апоптозу не викликають його у клітинах. Тобто саме внутрішньоклітинним реакціям, а, значить, і цілій низці рецепторів і ферментів належить основна “апоптозорганізуюча” роль.

Можна виділити такі етапи (стадії) апоптозу: -первинна активація апоптозу, тобто, напр., дія проапоптичного фактору на рецептор (антиген); -далі передача сигналу в клітину й в клітині; -активація певних генів; -синтез білків “проапоптичних”, в ядрі –активація ендонуклеаз і фрагментація ДНК.

Молекулярні механізми апоптозу [Кайдашев, 1998] –початковий механізм активації апоптозу; -клітинні механізми, що забезпечують апоптоз; -генетичний контроль блокади й активації апоптозу; -молекули які інгібують або модулюють апоптоз.

1.Плазматична мембрана.

а) Плазматичні мембрани клітин містять трансмембранні рецептори – білки, які беруть участь у ініціації апоптозу – це, наприклад, Fas/Apo-1 (CD95) трансмембранний рецептор, який після взаємодії з відповідними лігандами індукує програмовану загибель клітини. Fas – рецептор належить до суперродини рецепторів факторів росту нервів і фактора некрозу пухлин. Він має екстрацелюлярний домен, трансмембранний домен і інтрацелюлярний домен, який є “доменом загибелі” (з ним взаємодіє ліганд). Має цей рецептор і “домен порятунку”, який гальмує апоптоз індукуючі процеси. Ліганд рецептора Fas виділений з цитотоксичних Т-лімфоцитів. Взаємодія сигнальних молекул з рецепторами ініціює активацію ліполітичних ферментів (фосфоліпази С, А₂, D і сфінгомієлінази) з наступним накопиченням продуктів гідролізу фосфоліпідів (арахідонової кислоти і її похідних – лейкотрієнів, діацилгліцеролу, цераміду інозитолтрифосфату та інш.).

Інший шлях участі СД95 – активація сфінгомієлінового шляху: стимулюється сфінгомієліназа – гідроліз мембранного сфінгомієліну на фосфохолін та церамід – церамід, як вторинний посередник (месенджер), викликає наступні етапи апоптозу. А саме, церамід активує церамід залежну протеїнкіназу, яка через низку цитоплазматичних білків приводить до зниження (блокування) проліферації і зниження експресії гену c-myc(його продукти – ядерні білки, які активують ядерні процеси).

Зазначимо, що експресія Fas-рецептора відбувається у інфікованих гепатоцитах (деякі вірусні інфекції печінкові).

б) При апоптозі відбувається порушення проникності іонотрофних рецепторів плазматичної мембрани (і внутрішньоклітинних мембран), які регулюють вміст калію, натрію, хлору, кальцію в результаті дії амінокислот аспартату і глутамату (нейротрансмітери). Особливо важливе підвищення концентрації кальцію в клітині.

в) Порфирином Т-лімфоцитів формуються пори через які у клітину проникають і іони кальцію і гранули з гранзимом В – активатором каспаз.

г) ПОЛ. Дуже часто апоптоз супроводжується посиленням перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і розвитком окислювального стресу.

д) Фізико-хімічні зміни клітинних мембран – фосфоліпіди плазматичної мембрани є джерелом вторинних посередників, що приймають участь у регуляції ферментів апоптозу (протеїнкіназ, фосфатаз, протеаз). Ці посередники – арахідонова кислота і її похідні лейкотрієни, діацилгліцерол, інозитолфосфат та інш. Перебудовуються вуглеводні компоненти мембрани (з втратою сіалових кислот), що надає можливості взаємодії апоптизуючої клітини з макрофагами. Відбувається інверсія мембранних фосфоліпідів: зазвичай зовнішня поверхня мембранного бішару містить в основі нейтральні фосфоліпіди сфінгомієлін і фосфотидилхолін, тоді як від’ємно заряджені фосфоліпіди на внутрішній стороні. У апоптозуючих клітин назовні розташовується фосфатидилсерин, який розпізнається специфічним макрофагальним рецептором.

е) Кріплення апоптичної клітини до макрофагу тромбоспондіном, білком який синтезується і виштовхується у мікрооточення макрофагами.

2. Цитоплазма. Основними внутрішньоклітинними апоптичними подіями є розщеплення внутрішньоклітинних білків, перш за все білків цитоскелету, а також рецепторних білків клітини. Ці реакції відбуваються завдяки активації цистеїнових протеаз – каспаз. Екзогенно, з цитотоксичних лімфоцитів як компоненти утворюваних ними цитоплазматичних гранул, надходять до клітин, що апоптизують серинові протеази, наприклад грамзин В / фрагментин.

3. Внутрішньоклітинні органели. Значна частина сучасних наукових відкриттів дозволяє вважати, що в більшості випадків вирішальною для перебігу апоптозу і, взагалі, для його ініціації є зміни функціонування мітохондрій. В 1996 році Wang et al. Дослідили як в клітинах людини функціонує “екзекуційна” каспаза-3. Для активації цього ферменту з неактивної форми (прокаспаза-3) необхідно два білки: Apaf-1(фактор активації апоптичних протеаз) і цитохром с, який є мітохондріальним білком і потрапляє до цитоплазми завдяки зміні проникності мітохондріальної мембрани для нього Це не єдиний апоптогенний білок мітохондрій. До таких належить і AIF – апоптоз-індукуючий фактор – флавопротеїн, здатний до індукції конденсації і фрагментації ДНК в ізольованому ядрі незалежно від активності “каспазного шляху апоптозу”. Цей білок змінює і трансмембранний мітохондріальний потенціал та розташування фосфатидилсерину в плазматичній мембрані. Гомологи цього білка знайдені у трьох царствах багатоклітинних: тварин, рослин і грибів, що свідчить – AIF може бути одним з найдавніших та “найспадковіших” факторів загибелі клітин. Під час апоптозу з мітохондрій звільняється ще один білок – Diablo/Smac, який нейтралізує інгібіторів каспаз (IAPs), чим і “звільняє” каспази для їх апоптогенної роботи. Загалом, шляхи надходження мітохондріальних білків індукторів апоптозу – питання, що нині інтенсивно досліджується науковцями.

Зазначимо, що зміна функцій і структури мітохондрій – один з ключових моментів перебігу апоптозу. Зокрема, Са-залежна зміна проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани пов’язана з мітохондріальної деполяризацією, роз’єднанням окисного фосфорилювання і розбухання мітохондрій, як наслідок, порушення їх функцій. Це важливо, оскільки, швидкість “виведення з дії” мітохондрій обмежує продукцію АТФ і, відповідно, завершення енергозалежного апоптозу, чи ж, при вичерпуванні “запасів” АТФ перехід клітинної загибелі з апоптичного шляху до некротичного (вторинний некроз).

4. Ядро. Внутрішньоядерні апоптичні процеси можна умовно поділити на дві окремі у часі групи:

а) перша пов’язана з активацією проапоптичних (індукуючих апоптоз) генів і біосинтезом відповідних апоптичних білків,

б) друга – міжнуклеосомальна фрагментація ДНК.

а) Основна мета внутрішньоклітинних шляхів реалізації апоптозу: активація геномних реакцій клітин, тобто необхідно викликати синтез та активацію й накопичення специфічних білків (а отже, “вімкнути” роботу генетичних послідовностей, що їх кодують), які й реалізуватимуть, здійснюватимуть подальші “біохімічні ” стадії апоптозу, - і як наслідок, відбуватимуться морфологічні зміни в клітинах, що підлягають апоптичній елімінації. В клітині існує два класи генів і відповідних білків: необхідних для протікання апоптозу і блокаторів апоптозу.

Гени, що регулюють апоптоз

б) міжнуклеосомальна фрагментація ДНК є необоротною стадією апоптозу і відбувається з утворенням полідезоксирибонуклеотидів по 180-200 пар основ. В утворенні цих фрагментів ДНК беруть участь різні ядерні ферменти, а на більш пізніх стадіях цитозольні ферменти, це Ca²⁺, Mg²⁺–залежна ендонуклеаза, топоізомераза ІІ, протеолітичні ферменти, ДНКаза І, ДНКаза ІІ. Велике значення має концентрація іонів кальцію (чим їх більше тим інтенсивніше йде фрагментація).

Генетичні і молекулярні механізми апоптозу були вперше охарактеризовані в кінці 80-х на початку 90-х в дослідах на нематоді Caenorhabditis elegans. Досліди показали, що апоптоз складається з 4 послідовних етапів:

1) поштовх до апоптичної загибелі внутрішньо- чи зовнішньоклітинними тригерами і “увімкнення” генетичних програм апоптозу (вірніш, зрушення рівноваги апопозіндуктори – апоптозінгібітори в бік апоптозіндукторів);

2) клітинна екзекуція шляхом активації внутрішньоклітинних протеаз;

3) поглинання залишків клітини іншими клітинами;

4) деградація клітинних залишків за участі лізосом фагоцитарних клітин.

Таким чином, в геномі будь-якої клітини є гени, що реагують на дію індукторів чи інгібіторів апоптозу і, відповідно, є активаторами чи блокаторами цього процесу.