Практична робота. Дослід 1. Дослідження дії фенолоксидази.

Дослід 1. Дослідження дії фенолоксидази.

Принцип методу. Метод базується на явищі забарвлення пірокатехіну в разі окиснення його молекулярним киснем за присутності фенолоксидази.

Матеріальне забезпечення: розчин пірокатехіну, 2 г свіжої картоплі, дистильована вода, розчин натрію сульфіду, ступка, штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. Одержання свіжого соку з картоплі: 1 – 2 г свіжої картоплі розтирають у ступці, додають 25 мл води, перемішують і зливають розчин у пробірку (ножем подрібнювати картоплю не можна, тому що іони заліза спричинюють потемніння).

У 4 пронумеровані пробірки наливають по 0, 5 мл свіжого картопля­ного соку. У першу пробірку додають 0, 5 мл пірокатехіну, у другу – 1 – 2 краплі інгібітора натрію сульфіду та 0, 5 мл пірокатехіну. Вміст третьої пробірки кип’ятять, а потім вміщують 0, 5 мл пірокатехіну. У четверту пробірку доливають 0, 5 мл дистильованої води.

Усі пробірки ставлять на водяну баню на 30 хв. при температурі 37° С. Вміст пробірок перемішують для кращого доступу кисню. Розчин пер­шої пробірки забарвлюється внаслідок окиснення пірокатехіну киснем за присутності фенолоксидази. Колір розчинів у другій, третій, четвертій пробірках не змінюється.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 2. Дослідження дії альдегіддегідрогенази.

Принцип методу. Метод базується на знебарвленні метиленового синього за умови його відновлення альдегідом у присутності ферменту альдегіддегідрогенази. Дегідрогеназа, що міститься в молоці, легко окиснює формальдегід у мурашину кислоту. При цьому відбувається перенесення водню на метиленовий синій, який знебарвлюється:

Матеріальне забезпечення: нейтралізований альдегід, розчин метиленового синього, молоко, штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. Готують 3 пронумеровані пробірки. В першу наливають 1 мл молока, 1 – 2 крап. нейтралізованого альдегіду і 2 краплі розчину метиленового синього. У другу пробірку – 1 мл молока та 2 краплі метиленового синього. В третю пробірку – 1 мл прокип'яченого молока, 1 – 2 краплі нейтралізованого альдегіду і 2 краплі розчину метиленового синього. Вміст усіх трьох пробірок перемішують і ставлять на водяну баню на 30 хв при температурі 37°С.

У першій пробірці розчин метиленового синього знебарвлюється. У другій і третій знебарвлення не спостерігають.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 3. Дослідження дії пероксидази.

Принцип методу. Метод базується на здатності пероксидази за присутності гідрогену пероксиду каталізувати окиснення бензидину, яке супроводжується його наступним забарвленням.

Матеріальне забезпечення: витяжка з хрону, 3 %-ний розчин гідрогену пероксиду, розчин бензидину в ацетатній кислоті, інгібітор пероксидази, штатив із пробірками, піпетки, газовий пальник.

Хід роботи. Готують 3 пронумеровані пробірки. В першу вливають 3-4 краплі розчину бензидину в ацетатній кислоті, 3-4 краплі 3 %-го розчину гідрогену пероксиду та 3-4 краплі витяжки з хрону. В другу пробірку вносять 3-4 краплі розчину бензидину в ацетатній кислоті, 3-4 краплі 3 %-го розчину гідрогену пероксиду та 3-4 краплі прокип’яченої витяжки з хрону. В третю пробірку до 3-4 крапель розчину бензидину додають інгібітор пероксидази, витяжку з хрону, після перемішування додають 3-4 краплі гідрогену пероксиду.

У першій пробірці спостерігають появу синього забарвлення. В другій та третій пробірках забарвлення відсутнє.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Ферменти, які беруть участь у транспортуванні електронів у процесах тканинного дихання, відносяться до окисно-відновних. Зокрема, до них належать цитохроми - залізопорфіринові ферменти, простетична група яких містить різні похідні гему. Атом феруму в гемі може змінювати валентність, приєднуючи або віддаючи електрони. Препарат цитохрому с використовують для покращення тканинного дихання асфіксії новонароджених, при астматичних станах, хронічній пневмонії, серцевій недостатності, ішемічній хворобі серця, інфекційному гепатиті при інтоксикаціях та інших станах, що супроводжуються порушенням окиснювальних процесів в організмі.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Дослідження дії якого з перерахованих ферментів базується на знебарвленні бензидину при його окисненні?

А. Пероксидази

В. Цитохрому С

С. Альдегіддегідрогенази

D. Фенолоксидази

Е. Лактатдегідрогенази

2. Який інгібітор використовують для дослідження дії фенолоксидази?

А. Малонат

В. FeCl₃

С. Йодацетамід

D. Na₂S

Е. CuSO₄

3. За яких умов відбувається забарвлення пірокатехіну при окисненні його молекулярним киснем в присутності фенолоксидази:

А. За наявності Na₂S

В. Після кип’ятіння картопляного соку

С. За відсутності пірокатехіну

D. У присутності картопляного соку та пірокатехіну

Е. За відсутності пірокатехіну

4. Масова доля феруму в цитохромі с становить 0, 426 %. Розрахуйте молекулярну масу цитохрому і опишіть значення цього ферменту.

5. У новонароджених, на відміну від дорослих, міститься деяка кількість бурого жиру. Поясніть таку особливість будови організмів різного віку, якщо відомо, що бурий жир містить велику кількість мітохондрій, а вихід АТФ у ньому в перерахунку на атом поглинутого кисню становить менше одиниці.

Приклади тестів “Крок-1”

1. Ферменти дихального ланцюга здійснюють окиснення біологічних субстратів та транспортування відновлюваних еквівалентів на кисень з утворенням молекули води. Де вони локалізуються?

А. На плазматичній мембрані

В. В цитоплазмі

С. На зовнішній мембрані мітохондрій

D. В матриксі мітохондрій

Е. На внутрішній мембрані мітохондрій

2. Цитохроми – компоненти дихального ланцюга мітохондрій, що здійснюють перенос електронів від убіхінону на молекулярний кисень. Яка частина молекули цитохрома бере участь в окисно-відновних реакціях?

А. Вінільний радикал

В. Пірольне кільце

С. Білкова частина

D. Атом заліза

Е. Метиновий мостик

3. НАДН+Н⁺-дегідрогеназа – фермент, що знаходиться на внутрішній мембрані мітохондрій, який в якості коферменту містить:

А. НАД⁺

В. ФАД

С. ФМН

D. НАДН+Н⁺

Е. НАДФ

4. Назвати останній компонент мультиензимного комплексу дихального ланцюга мітохондрій, що здатний транспортувати як електрони, так і протони:

А. Убіхінон

В. НАД

С. Залізо-сірчаний білок

D. Цитохром в

Е. Цитохром а₃

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1. Розвиток вчення про біологічне окиснення. Значення праць А.М. Баха, В.І. Паладіна та О. Варбурга.

2. Сучасні уявлення про організацію дихального ланцюга як єдиного поліферментативного комплексу.

Література

Основна:

1. Біологічна хімія: Тести та ситуаційні задачі. / За ред. проф.О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – 360 с.

2. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

5. Клінічна біохімія / за ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006.- 432 с.

6. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 298 с.

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина, 1998. – 701 с.

2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.: Мир, 2004. – 381 с.

4. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологическая химия: Практикум. – К.: Вища школа, 1985. – 212 с.

Тема № 8. Дослідження дії інгібіторів та роз’єднувачів окисного фосфорилування.

Мета заняття: Засвоїти основні принципи хеміосмотичної теорії Мітчела. Оволодіти методом визначення активності каталази в крові, навчитись використовувати цей показник в клініко-діагностичних цілях.

Актуальність теми: Хеміосмотична теорія окисного фосфорилування пояснює молекулярні механізми генерації АТФ в ході біологічного окиснення. При деяких патологічних процесах, які супроводжуються гіпоксією, може відбуватися неповне відновлення молекули кисню в дихальному ланцюзі та накопичення гідрогену пероксиду, розщеплення якого каталізує фермент каталаза. Тому визначення її активності є важливим критерієм для оцінки антиоксидантного стану організму.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізми спряження біологічного окиснення та окисного фосфорилування – синтезу АТФ;

Ø Аналізувати структурно-функціональні особливості функціонування дихального ланцюга, що забезпечують ефективний синтез АТФ;

Ø Пояснювати основні засади хеміосмотичної теорії окисного фосфорилування;

Ø Аналізувати дію інгібіторів і роз’єднувачів окисного фосфорилування природного та синтетичного походження, їх фізіологічне значення.

Теоретичні питання

1. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилування – молекулярний механізм генерації АТФ в процесі біологічного окиснення.

2. Електрохімічний градієнт протонів (Dm_Н⁺), що утворюється під час функціонування електронно-транспортного ланцюга його роль у спряженні транспорту електронів в мітохондріях з синтезом АТФ. Пункти спряження транспорту електронів та фосфорилування,

3. Схема хеміосмотичного механізму спряження транспорту електронів у дихальному ланцюгу з синтезом АТФ. Молекулярна будова та принцип дії АТФ-синтетази. Коефіцієнт окисного фосфорилювання.

4. Регуляція тканинного дихання (дихальний контроль).

5. Інгібітори транспорту електронів в дихальному ланцюгу мітохондрій.

6. Роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилування в дихальному ланцюгу мітохондрій.

7. Порушення синтезу АТФ в умовах дії на організм людини патогенних факторів хімічного, біологічного та фізичного походження.

8. Активні форми кисню, механізми їх утворення та інактивації.