Практична робота. Дослід 1. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Дослід 1. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Принцип методу. Сполуками, що підвищують активність ферментів – активаторами – є іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі.

Активатором амілази є натрію хлорид (NaCl), інгібітором –купруму сульфат (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Матеріальне забезпечення: 1 % р-н крохмалю, 0, 1 %-й розчин йоду в 0, 2%-му розчині йодиду калію, 5 % р-н CuSO₄, 1 %-й розчин NaCl, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку № 1 наливають 1 мл води, в пробірку № 2 – 0, 8 мл води та 0, 2 мл 1% -го розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0, 8 мл води та 0, 2 мл 1 %-го розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1 мл слини. Вміст перемішують і додають по 2 мл 1 % -го розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t = 37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом (0, 1 %-й розчин йоду в 0, 2 %-му розчині йодиду калію). Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин) – інгібітор циклооксигенази (простагландинсинтази) використовується як протизапальний препарат, трасилол – інгібітор трипсину та контрикал – інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Дослід 2.Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

При проведенні нервового збудження відбувається зростання концентрації іонів Са²⁺ у нервовому закінченні, що є сигналом для активації виходу ацетилхоліну у синаптичну щілину, взаємодії його з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщепленням ацетилхолінестеразою. Окрім цього, іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що затратилась на титрування є мірою активності ферменту.

Матеріальне забезпечення: 0, 5 % розчин CaCl₂, 0, 05 % розчин фосфаколу, 5 % розчин CuSO₄, 2 %-й розчин ацетилхоліну, NaOH 0, 1 М, розчин фенолфталеїну, сироватка крові, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна ацилхолінестераза (КФ 3.1.1.8), яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін (КФ 3.1.1.7).

У норміактивність холінестеразив сироватці крові становить 44, 4 – 94, 4 мккат/л (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишківника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібіториацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Вкажіть який тип інгібування спостерігається при застосуванні інгібітора ацетилхолінестерази – прозерину:

А. Конкурентне

В. Зворотне

С. Неконкурентне

D. Безконкурентне

Е. Алостеричне

2. Ацетилхолінестераза – фермент, що здійснює розщеплення ацетилхоліну. Інсектициди, пестициди та отрути з нервово-паралітичною дією на основі фторфосфатів, незворотньо інгібують ацетилхолінестеразу. Вкажіть механізм інгібування:

А. Інгібітори є структурними аналогами субстрату

В. Інгібітори зв'язуються зі залишком гістидину в алостеричному центрі

С. Інгібітори зв'язуються зі залишком серину в активному центрі ферменту

D. Інгібітори утворюють комплекс з ацетилхоліном

Е. Інгібітори викликаюсть денатурацію ферменту

3. Константа Міхаеліса дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює:

А. Максимальній

В. Мінімальній

С. Половині максимальної

D. Половині мінімальної

Е. Третині максимальної

4. Конкурентними інгібіторами сукцинатдегідрогенази є:

А. Сукцинат

В. Аланін

С. Малонат

D. Фумарат

Е. a-Кетоглутарат

5. Хворого доставила в стаціонар швидка допомога з попереднім діагнозом – гострий панкреатит. Активність якого ферменту в крові та сечі необхідно визначити для підтвердження цього діагнозу?

А. АлАТ

В. АсАТ

С. α -Амілази

D. γ -Амілази

E. Лактадегідрогенази

6. У хворого в сироватці крові виявлено підвищення активності ЛДГ₄ і ЛДГ₅, аланінамінотрансферази, карбамоїлорнітинтрансферази. В якому органі можна передбачити розвиток патологічного процесу?

7. В інкубаційне середовище, де була сукцинатдегідрогеназа і бурштинова кислота, додали малонову кислоту. Як зміниться активність ферменту? Чи є цей процес зворотнім? Як його повернути?

8. У хворого гнійна рана. Чи можна для її лікування використовувати ферменти? Які саме? На чому заснована їх лікувальна дія?

9. Поясніть вплив модуляторів на активність ферментів на прикладі визначення активності холінестерази у присутності хлориду кальцію та фосфаколу, на прикладі активності амілази слини у присутності хлориду натрію.

Приклади тестів “Крок-1”

1. При обстеженні хворого виявлено підвищення в крові активності ЛДГ. Це характерно для хвороб серця, печінки, нирок. Яке додаткове біохімічне обстеження треба зробити для диференціальної діагностики?

А. Визначення цукру крові

В. Рівень ацетонових тіл

С. Визначення ізоферментів ЛДГ

D. Визначення рівня холестерину

Е. Активність амілази крові

2. Хворому в курсі лікування туберкульозу призначили ізоніазид – структурний аналог нікотинаміду і піридоксину. До якого типу інгібування за механізмом дії належить ізоніазид?

А. Алостеричне

В. Незворотне

С. Безконкурентне

D. Конкурентне

Е. Неконкурентне

3. Для лікування певних інфекційних захворювань використовують сульфаніламідні препарати, які гальмують ріст бактерій. Який механізм їх дії?

А. Алостерично інгібують ферменти бактерій

В. Є структурними аналогами параамінобензойної кислоти, необхідної для синтезу фолієвої кислоти

С. Беруть участь в окисно-відновних процесах

D. Інгібують всмоктування фолієвої кислоти

Е. Незворотньо інгібують синтез фолієвої кислоти, необхідної для нормального функціонування бактерій

4. Який фермент використовується як фармпрепарат для лікування гнійних ран?

А. Каталаза

В. Лужна фосфатаза

С. Трипсин

D. Кисла фосфатаза

Е. Аргіназа

5. У хворого зі скаргами на болі у ділянці серця за визначенням активності ферментів сироватки крові діагностовано інфаркт міокарда. Вкажіть, активність яких ферментів використовували?

А. Амілази, ліпази, фосфатази

В. ЛДГ, креатинкінази, трансамінази

С. Пептидази, аргінази, глюкокінази

D. Трипсину, лізоциму, цитратсинтази

Е. Альдолази, сукцинатдегідрогенази, гексокінази

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Регулятори активності ферментів та їх використання в клінічній практиці.

2. Ензимодіагностика. Використання ізоферментів у ензимодіагностиці.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.86-137.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.66-107.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

Додаткова:

1. Клінічна біохімія: Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Тема № 5. Дослідження ролі кофакторів та коферментних вітамінів у прояві каталітичної активності ферментів.

Мета заняття: Засвоїти будову, загальні принципи класифікації та функціонування коферментних форм вітамінів. Оволодіти методами якісного та кількісного визначення вітамінів.

Актуальність теми: Водорозчинні вітаміни беруть участь в обміні речовин як коферменти і активатори багатьох ферментативних процесів.

Обмеження надходження вітамінів в організм або патологія їх обміну, пов’язана з порушенням всмоктування, перетворення вітамінів у коферментні форми, різко знижує інтенсивність енергетичного та пластичного обмінів, що супроводжується порушенням функцій головного мозку, серця, печінки та інших органів, зниженням імунітету до вірусних та інфекційних захворювань, втратою організмом здатності адаптуватись до різних несприятливих факторів.

Недостатнє забезпечення організму вітамінами призводить до розвитку гіповітамінозів із характерними клінічними проявами.

Конкретні завдання:

1. Вміти трактувати роль вітамінів та їх біологічно активних похідних в механізмах каталізу за участю основних класів ферментів;

2. Пояснювати застосування антивітамінів як інгібіторів ферментів при інфекційних захворюваннях та при патологіях системи гомеостазу;

3. Пояснювати роль металів в механізмі ферментативного каталізу;

4. Класифікувати окремі групи коферментів за хімічною природою та типом реакції, яку вони каталізують.

Теоретичні питання

1. Кофактори, коферменти та простетичні групи. Визначення, приклади.

2. Роль іонів металів (Cu²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Fe ²⁺, тощо) у функціонуванні ферментів.

3. Класифікація коферментів за хімічною природою та за типом реакції, яку вони каталізують.

4. Коферменти – переносники атомів водню та електронів (представити структурні формули):

• НАД⁺, НАДФ⁺ - коферменти – похідні вітаміну РР;
• ФАД, ФМН – коферменти – похідні вітаміну В₂ – рибофлавіну;
• роль вітаміну С в окисно-відновних реакціях;
• металопорфірини.

5. Коферменти – переносники хімічних груп (представити структурні формули):

• піридоксалеві коферменти;
• НS-КоА – коензим ацилювання;
• ліпоєва кислота;
• ТГФК – похідні фолієвої кислоти.

6. Коферменти ізомеризації, синтезу та розщеплення С – С зв’язків (представити структурні формули):

• Тіаміндифосфат – похідні вітаміну В₁;
• карбоксибіотин – біологічно активна форма вітаміну Н – біотину;
• метилкобаламін та дезоксиаденозилкобаламін – похідні вітаміну В₁₂.