Практична робота. Дослід 1.Виявлення амілази в слині (реакція з йодом).

Дослід 1.Виявлення амілази в слині (реакція з йодом).

Принцип методу. Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю (розрив глікозидних зв’язків) через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози, про що свідчить реакція на крохмаль з йодом та реакція Тромера на мальтозу. Крохмаль утворює з йодом синє забарвлення і не дає забарвлення в реакції Тромера, оскільки не містить вільних альдегідних груп. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0, 5 % розчин крохмалю, 0, 1 % І₂ в КІ, 10 % розчин NaOH, 5 % розчин CuSO₄, дистильована вода, газовий пальник, пробірки, піпетки, штатив.

Хід роботи. Для одержання розведеної слини ротову порожнину злегка прополіскують водою, набирають нову порцію дистильованої води і прополіскують нею рот протягом 1-2 хв. Зібрану в пробірку рідину використовують для аналізу.

Щоб переконатись у тому, що крохмаль з йодом дає синє забарвлення, в пробірку вносять 10 крапель розчину крохмалю та додають 2 краплі розчину I₂ в KI. Спостерігають позитивну реакцію.

У штатив ставлять 10 пробірок і наливають у кожну по 2 мл дистильованої води та додають по одній краплі розчину І₂ в KI.

В окрему пробірку наливають 5 мл 0, 5 % розчину крохмалю, додають 1 мл розведеної слини, вміст пробірки перемішують і спостерігають опалесценцію. З цієї пробірки кожних 60 секунд відбирають по 0, 5 мл рідини і вносять по черзі в пробірки № 1, 2, 3 і т.д., що були заготовлені з розчином І₂ в KI. Якщо після першого перенесення в пробірці спостерігають фіолетове або червоне забарвлення, то інтервал між перенесенням скорочують до 30 секунд.

Якщо чергова проба не змінює жовтого кольору розчину йоду, гідроліз крохмалю вважається закінченим. Відзначають час. Спостерігають зникнення опалесценції розчину в процесі гідролізу. Через 10 хв проводять пробу Тромера.

Для проведення проби Тромера до вмісту пробірки з реактивною сумішшю додають рівний об’єм 10 % розчину NaOH і 5-7 крапель 5 % розчину CuSO₄. Вміст пробірки перемішують до зникнення помутніння. Верхню частину пробірки обережно нагрівають на відкритому вогні до кипіння, реакція Тромера повинна бути позитивною, що відзначають за появою жовто-червоного осаду.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 2. Дослідження термолабільності амілази слини.

Принцип методу. Метод базується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити при допомозі проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0, 5 % р-н крохмалю, 0, 1 розчин І₂ в KІ, 10 % р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, холодна вода (лід), штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У пробірку вносять 2 мл розведеної слини і кип’ятять на відкритому вогні протягом 2 хв. Вміст пробірки охолоджують. В три інші пробірки вносять по 5 мл 0, 5 % р-ну крохмалю. В пробірку № 1 додають прокип’ячену слину, а в пробірки № 2 і № 3 по 2 мл розведеної непрокип’яченої слини. Пробірку № 2 ставлять на 10 хв на водяну баню при температурі 37°С. Пробірку № 3 поміщають на 10 хв у холодну воду. Після інкубації вміст кожної пробірки розділяють порівну. До відібраних проб додають по 3-5 крапель р-ну І₂ в KІ і спостерігають за зміною забарвлення. З пробами, що залишилися проводять реакцію Тромера (див. дослід № 1).

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 3.Вивчення специфічності дії амілази слини та сахарази дріжджів.

Принцип методу. Специфічність дії є однією з найбільш характерних властивостей ферментів і полягає в тому, що кожен фермент діє на певний субстрат чи групу субстратів, які мають подібну структуру. Розрізняють абсолютну, відносну (групову) та стереохімічну специфічність. Висока специфічність ферментів обумовлена їх білковою природою та структурою активного центру.

Амілаза слини розщеплює крохмаль до дисахариду – мальтози і не діє на дисахарид – сахарозу, сахараза розщеплює сахарозу на глюкозу та фруктозу і не діє на крохмаль. Ступінь гідролізу субстратів оцінюють за результатами реакції Тромера. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлення з реактивом Троммера, а сахароза не містить вільної альдегідної групи, тому не дає реакції.

Матеріальне забезпечення: 1 % р-н крохмалю, препарат сахарази дріжджів, 1 %-го розчин сахарози, 0, 1 розчин І₂ в KІ, 10 % р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи.

Специфічність амілази: в пробірки № 1 і 2 поміщають по 1 мл розведеної в два рази слини. В пробірку № 1 додають 2 мл 1 %-го розчину крохмалю, в пробірку № 2 – 2 мл 1 %-го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Специфічність сахарази дріжджів: в пробірки № 3 і 4 поміщають по 1 мл препарату сахарази дріжджів. В пробірку № 3 додають 2 мл 1 %-го розчину сахарози, в пробірку № 4 – 2 мл 1 %-го розчину крохмалю. Обидві пробірки ставлять в термостат при t = 37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Результати проведеного експерименту заносять в таблицю:

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Амілаза синтезується переважно в слинних та підшлунковій залозах. Підвищення активності амілази в крові спостерігається при панкреатиті, перитоніті, тромбозі судин, внаслідок введення в організм ряду фізіологічно активних сполук, зокрема морфіну, кодеїну, кортикотропіну (АКТГ) та кортизолу.

Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігається при стоматиті, невралгії лицевого нерва, нирковій недостатності, паркінсонізмі. Зниження активності амілази крові спостерігається при психічних захворюваннях, анацидних порушеннях. Зниження вмісту амілази в слині має місце при гіпосалівації, запаленні слинних залоз, тощо.

Дослід 4. Дослідження впливу рН середовища на активність амілази слини.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення за умов оптимального для амілази рН середовища. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0, 5 % р-н крохмалю, 0, 1 н розчин I₂ в KI, 10% р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У три пробірки вносять по 2 мл 0, 5 %-го р-ну крохмалю. У першу додають 2 мл фосфатного буферу з рН 5, 0, у другу – з рН 7, а в третю – з рН 9. В кожну з пробірок вносять по 1 мл розведеної слини і поміщають їх у водяну баню при температурі 37^°С.

Після інкубації вміст кожної пробірки ділять порівну. До перших фракцій додають по 3-5 краплі р-ну І₂ в KI і спостерігають за зміною забарвлення. З фракціями, що залишилися проводять пробу Тромера (див. дослід № 1).

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Що відбувається з ферментами за умов високої температури?

А. Гідроліз

В. Денатурація

С. Утворення фермент-субстратного комплексу

D. Блокування активного центру

Е. Порушення первинної структури

2. Встановити співвідношення Ферменти – Специфічність дії:

А. Хімотрипсин 1 – стереоспецифічність

В. Уреаза 2 – групова специфічність

С. Фумараза 3 – абсолютна специфічність

D. Пепсин

Е. Сахараза

3. Пригнічення швидкості ферментативної реакції при надмірній концентрації субстрату пов’язане з:

А. Блокуванням алостеричного центра

В. Денатурацією ферменту

С. Насиченням алостеричних центрів

D. Насиченням активного центру

Е. Підвищенням температури середовища

4. Роль активного центру полягає у:

А. Регуляції активності ферментів

В. Прикріпленні ферментів до мембран

С. Зв’язуванні та перетворенні субстратів

D. Взаємодії ферментів між собою

Е. Зв’язуванні алостеричних ефекторів

5. Фермент здійснює перенос структурного фрагменту від одного субстрату до іншого з утворенням двох продуктів. Назвіть клас цього ферменту.

A. Трансферази

B. Ізомерази

C. Оксидоредуктази

D. Лігази

E. Гідролази

6. У чому полягає небезпека надмірного підвищення температури тіла?

7. Для збереження трансплантантів їх заморожують. Обґрунтуйте такі дії.

8. Поясніть термолабільність ферментів на прикладі визначення амілази слини, яка була попередньо нагріта або охолоджена, та амілази слини, яка не була попередньо оброблена.

9. У хворого розвинувся метаболічний ацидоз. Як це вплине на активність внутрішньоклітинних ферментів?

10. У деяких людей відсутні гени, які кодують фермент лактазу. Поясніть, чому при вживанні такими людьми свіжого молока спостерігаються розлади шлунково-кишкового тракту.

11. Доведіть білкову природу ферментів біуретовою реакцією, реакцією Фоля, методом формол-титрування за Серенсеном. Поясніть принципи цих методів.

12. Намалюйте графік залежності швидкості ферментативних реакцій від зміни рН середовища за результатами визначення активності амілази слини.

Приклади тестів „Крок-1”

1. У хворого з болями у животі виявили високу амілазну активність у крові та сечі. Який патологічний процес супроводжують ці зміни?

А. Гепатит

В. Панкреатит

С. Перфоративна виразка шлунка

D. Гострий гастрит

Е. Жовчокам’яна хвороба

2. Після додавання витяжки з підшлункової залози в пробірку з розчином крохмалю, відмічено відсутність синього забарвлення в пробі з розчином йоду, що свідчило про гідроліз крохмалю. Під впливом якого ферменту підшлункової залози це відбулося?

А. α -Амілази

В. Хімотрипсину

С. Ліпази

D. Альдолази

Е. Трипсину

3. У слині міститься фермент, здатний руйнувати α -l, 4-глікозидні зв’язки в молекулі крохмалю. Назвіть цей фермент.

A. α -Амілаза

B. Фосфатаза

C. Фруктофуранозидаза

D. β -Галактозидаза

Е. Лізоцим

4. Важливим ферментом слини є лужна фосфатаза. До якого класу ферментів вона належить?

А. Оксидоредуктаз

В. Трансфераз

С. Гідролаз

D. Ліаз

Е. Лігаз

5. Зниження активності якого ферменту слини служить показником гіпофункції привушної залози?

А. Фосфоглюкомутази

В. Мальтази

С. Лізоциму

D. Амілази

Е. Глюкокінази

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Мультиферментні комплекси, особливості будови та каталізу.

2. Використання ферментів у біохімічних дослідженнях.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.86-137.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.66-107.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.51-66.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

Додаткова:

1. Клінічна біохімія. Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Тема № 3. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

Мета заняття: На прикладі пептидаз панкреатину і амілази слини показати каталітичну роль ферментів у хімічних перетвореннях. Засвоїти методику визначення активності пептидаз і амілази слини та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Актуальність теми: Знання механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу лежить в основі розуміння метаболічних процесів у клітинах, тканинах та органах організму, що важливо для засвоєння перебігу хімічних перетворень і застосування ферментних препаратів, їх інгібіторів у практичній медицині.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що перебігають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

Ø Аналізувати механізм дії ферментів на прикладі хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Теоретичні питання

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

• за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;
• за кількістю субстрату, що використовується;
• за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД);

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

• залежність швидкості реакції від концентрації субстрату (пояснити і зобразити графічно);
• залежність швидкості реакції від концентрації ферменту (пояснити і зобразити графічно);
• утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;
• рівняння Міхаеліса-Ментен;
• смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).
• вираз ферментативної реакції в подвійних зворотних величинах; рівняння Лануівера-Берка.

4. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

• ефекти зближення та орієнтації;
• ефекти кислотно-основного каталізу;
• ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

5. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.