Практична робота. Дослід 1. Виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).

Дослід 1. Виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).

Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях відбуваються реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилування. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, а компоненти дихального ланцюга локалізовані на внутрішній мембрані мітохондрій.

Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим наконечником, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Швидкість осадження клітинних компонентів під дією відцентрової сили залежить від їх маси, розміру, а також часу центрифугування.

Матеріальне забезпечення: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0, 25 М розчин сахарози і 0, 01 М розчин етилендіамінтетраацетатної кислоти (ЕДТА – для зв’язування кальцію, рН = 7, 6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0, 25 М розчин сахарози в 0, 02 М розчині трис-буфера з рН = 7, 5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хв. при швидкості обертання – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі + 1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та уламків клітинних мембран шляхом центрифугування впродовж 6 хв. при 700 об/хв. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують протягом 10 хв при 7000 об/хв.

Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспендують, а потім проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв при 7000 об/хв. Осад мітохондрій ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка.

Отриману суспензію мітохондрій використовують для проведення дослідів 2 – 4, а також для дослідження процесів тканинного дихання та окисного фосфорилування.

Дослід 2. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО₂ та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО₂. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂ не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (бурштинової кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сульфатної кислоти.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7, 4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин Са(ОН)₂, суспензія мітохондрій, 0, 1 М розчин H₂SO₄, термостат, штатив із пробірками, піпетки

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1, 0 мл 0, 1 М розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Дослід 3. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. При окисненні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

При блокуванні ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленова синька не знебарвлюється.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7, 4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, термостат, штатив із пробірками, піпетки

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:

Зробити висновки.

Дослід 4. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Сукцинатдегідрогеназа каталізує дегідрогенізацію сукцинату (бурштинової кислоти), в результаті чого утворюється фумарат (фумарова кислота). Кофактором ферменту є ФАД, який відновлюється в процесі реакції до ФАДН₂. Утворений в реакції ФАДН₂ відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7, 4, розчин бурштинової кислоти, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, 0, 1 М розчин H₂SO₄, термостат, штатив із пробірками, піпетки.

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами згідно табли:

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Багато речовин, у тому числі і лікарські засоби, можуть змінювати енергетику клітин, інтенсивність окислювального фосфорилування – утворення АТФ. Їх можна поділити на активатори та інгібітори енергетичного обміну. До активаторів належать кислоти циклу Кребса (лимонна, яблучна, бурштинова) та низка інших сполук (глюкоза, амінокислоти тощо), тому вони знайшли застосування у медичній практиці.

Лимонну кислоту у вигляді солей (цитрат натрію) використовують як засіб, що запобігає згортанню крові та може входити до складу деяких ліків.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Мітохондрії – субклітинні органели, що містяться в цитоплазмі всіх клітин за винятком зрілих еритроцитів, бактерій, синьо-зелених водоростей. Який основний метод застосовують для їх виділення?

А. Диференційне центрифугування

В. Хроматографію

С. Електрофорез

D. Спектрофотометрію

Е. Гель-фільтрацію

2. Принцип визначення активності сукцинатдегідрогенази базується на відновленні метиленового синього відновленою формою коферменту. Який кофермент входить до складу сукцинатдегідрогенази:

А. ТПФ

В. НАД

С. ФМН

D. ФАД

Е. ПАЛФ

3. Яка з вказаних сполук використовується як інгібітор для дослідження функціонування циклу трикарбонових кислот?

А. АТФ

В. НАД⁺

С. Аконітат

D. Ізоцитрат

Е. Малонат

4. Пацієнт поступив у стаціонар з діагнозом цукровий діабет І типу. Серед метаболічних змін має місце зниження швидкості синтезу оксалоацетату. Який метаболічний процес порушується в результаті цього? Які енергетичні втрати будуть спостерігатися при порушенні цього метаболічного процесу. Вказати, які метаболічні шляхи можуть активуватись для компенсації втрати енергії.

5. Якими методами можна довести функціонування ЦТК? Принцип визначення активності ферментів ЦТК. Довести функціонування ЦТК за використанням ацетил-КоА, за утворенням СО₂, за вивільненням водню.

6. В інкубаційне середовище, де були сукцинатдегідрогеназа і бурштинова кислота, додали малонову кислоту. Як зміниться активність ферменту? Яким чином можна позбавитись негативного впливу малонової кислоти? Намалюйте графік залежності активності сукцинатдегідрогенази від концентрації субстрату без малонової кислоти та в її присутності.

7. До якого класу та підкласу ферментів належать ферменти ЦТК?

Приклади тестів “Крок-1”

1. Ферменти циклу трикарбонових кислот здійснюють окиснення ацетил-КоА, що супроводжується відновленням 3 молекул НАД⁺ та однієї молекули ФАД. Де вони локалізуються

А. На плазматичній мембрані

В. В цитоплазмі

С. На зовнішній мембрані мітохондрій

D. В матриксі мітохондрій

Е. На внутрішній мембрані мітохондрій

2. До лікарні потрапив хворий з ознаками отруєння арсеном. Порушення якого процесу має місце, якщо відомо, що миш’як блокує ліпоєву кислоту?

А. Біосинтезу жирних кислот

В. Окисного декарбоксилування a-кетоглутарової кислоти

С. Знешкодження супероксидних аніонів

D. Спряження окиснення і фосфорилування

Е. Мікросомального окиснення

3. Субстратне фосфорилування – це процес безпосередньої передачі молекули активного фосфату із субстратів, які містять макроергічний зв'язок, на АДФ з утворенням АТФ. Вкажіть, який фермент циклу лимонної кислоти бере участь у реакції субстратного фосфорилування?

А. Цитратсинтаза

В. Сукцинатдегідрогеназа

С. Фумараза

D. Сукцинілтіокіназа

E. α -Кетоглутаратдегідрогеназний комплекс

4. Яка речовина є основним джерелом енергії (паливом) для функціонування циклу трикарбонових кислот?