Практична робота. Дослід 1. Кількісне визначення фосфоліпідів у сироватці крові.

Дослід 1. Кількісне визначення фосфоліпідів у сироватці крові.

Принцип методу. Фосфоліпіди осаджуються трихлорацетатною кислотою (ТХАК) разом з білками крові. У осаді після мінералізації визначають вміст фосфору.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, 10 % розчин ТХАК, 56 % розчин хлорної кислоти, розчин амонію молібденовокислого, 1% розчин аскорбінової кислоти, стандартний розчин КН₂РО₄ (0, 05 мг в 1 мл), центрифужні пробірки, центрифуга, водяна баня, фотоелектроколориметр (ФЕК), піпетки, пробірки, мікропіпетки.

Хід роботи. У центрифужну пробірку наливають 0, 2 мл сироватки крові, 2 мл дистильованої води. Додають 3 мл 10 % розчину ТХАК і через 1-2 хв центрифугують протягом 5 хв при 2000-3000 об/хв. Надосадову рідину зливають, не струшуючи пробірку. До осаду, що містить ліпопротеїни, додають 1 мл 56 % розчину HСlO₄ і нагрівають на киплячій водяній бані протягом 20-30 хв (до знебарвлення розчину). Після закінчення мінералізації у пробірку наливають 5 мл води, 1 мл молібденовокислого амонію та 1 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і перемішують. Одночасно реакцію проводять зі стандартним розчином фосфору. До 1 мл стандартного розчину (0, 05 мг/мл) додають 5 мл води, 1 мл амонію молібденовокислого та 1 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і перемішують. Через 15-20 хв розчини колориметрують на ФЕКу, використовуючи червоний світлофільтр і кювети на 10 мм проти води.

Розрахунок проводять за формулою:

Ад ´ 0, 05

Загальні ліпіди сироватки = -------------- ´ 25 мг/мл або г/л

Аст ´ 0, 2

Ад – оптична густина дослідної проби;

Аст – оптична густина стандартного розчину;

0, 05 – вміст фосфору в стандартному розчині (мг/мл);

0, 2 – об’єм взятої для досліду сироватки;

25 – перерахунок на загальні ліпіди.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Вміст загальних фосфоліпідів у сироватці крові 1, 5-3, 6 г/л, а лецитину – 0, 75-1, 2 г/л. Загальну концентрацію фосфоліпідів визначають за вмістом ліпідного фосфору, на долю якого припадає 4 % відносно молярної маси фосфоліпідів (0, 1-0, 15 г/л). Важливим показником є індекс фосфоліпіди/холестерол, який за фізіологічних умов становить 1–1, 5. Цей індекс знижується при атеросклерозі, гіпертонічній хворобі, хворобах печінки.

Визначення вмісту ліпідів у крові має важливе діагностичне значення. Підвищення рівня фосфоліпідів у сироватці крові (гіперфосфоліпідемія) спостерігається при важкій формі цукрового діабету (у 2-2, 5 разів), нефрозах, застійній жовтяниці та ін. Зниження рівня фосфоліпідів (гіпофосфоліпідемія) спостерігається при атеросклерозі, малокрів’ї, гарячкових станах, аліментарній дистрофії, захворюваннях печінки. Недостатнє надходження з їжею ліпотропних факторів (холіну, етаноламіну, метіоніну, інозиту) або недостатнє їх ендогенне утворення призводить до гальмування синтезу фосфоліпідів і до жирової інфільтрації печінки.

Дослід 2. Вплив жовчі на активність ліпази.

Принцип методу. Активність ліпази оцінюють за утворенням у результаті гідролізу жиру жирних кислот, кількість яких визначають титруванням лугом у присутності фенолфталеїну. Гідроліз жирів найзручніше спостерігати на прикладі витяжки з підшлункової залози (джерело ліпази) і молока як субстрату, жир якого знаходиться в емульгованому стані і швидко розщеплюється на гліцерин і жирні кислоти. Якщо в пробу долити жовч, то ліпаза активується і гідроліз жиру протікає швидше.

Матеріальне забезпечення: панкреатин, молоко кип’ячене і попередньо розведене 1: 1, жовч, 0, 5 % спиртовий розчин фенолфталеїну, 0, 05 н NaOH, водяна баня або термостат, мікробюретки, піпетки.

Хід роботи. У дві пробірки або колбочки наливають по 10 мл молока та по 0, 5 мл панкреатину. В одну пробірку доливають 1 мл води, а в другу – 1 мл жовчі. Вміст пробірок добре перемішують. З кожної пробірки відбирають по 1 мл суміші в інші пробірки, додають 1-2 краплі 0, 5 % розчину фенолфталеїну і відразу ж титрують 0, 05 н розчином натрію гідроксиду до появи слаборожевого забарвлення, яке не зникає протягом 30 секунд. Потім ці пробірки із залишком суміші вміщують у водяну баню або термостат при 37 С. Через кожні 10-15 хв з них відбирають по 1 мл суміші і проводять титрування, як і попереднього разу. Роблять 4-5 таких визначень. Результати виражають в мл розчину лугу, який затрачається на титрування.

Отримані дані вносять в таблицю і будують криву, відкладаючи по осі абсцис час у хв, а по осі ординат – кількість NаОН в мл, який пішов на титрування.

Клініко-діагностичне значення. Перетравлювання ліпідів відбувається в основному в кишечнику під дією активної панкреатичної ліпази, тому що в шлунковому соку ліпаза малоактивна і діє тільки на емульгований жир, наприклад молока для кращого перетравлювання. Ліпіди мають бути емульговані. Головним емульгатором ліпідів є жовч. Оскільки жовч емульгує жири, при додаванні жовчі ліпаза активується і гідроліз жирів відбувається з більшою швидкістю. Так як ліпаза є основним ензимом для перетравлення ліпідів, зміни її активності можуть свідчити про порушення певних ланок ліпідного обміну. Дефіцит панкреатичної ліпази викликає панкреатогенну стеаторею, яку спостерігають при хронічному панкреатиті, спадковій гіпоплазії pancreas, спадковому чи набутому дефіциті панкреатичної ліпази, а також при муковісцидозі. Вміст жовчних пігментів у калі при таких станах супроводжується зниженням вмісту вільних жирних кислот і значним приростом нерозщеплених жирів. Порушення емульгування, травлення і всмоктування ліпідів та жиророзчинних вітамінів можуть спричинятися також захворюваннями печінки, жовчного міхура або жовчних шляхів (жовчокам’яна хвороба).

Контроль виконання лабораторної роботи

1. У чому полягає принцип методу визначення фосфоліпідів у сироватці крові?

A. В осадженні фосфоліпідів трихлорацетатною кислотою і визначенні вмісту фосфору

B. В утворенні комплексної сполуки за присутності ацетатного ангідриду і суміші ацетатної і сульфатної кислот

C. В утворенні синього забарвлення з 2, 6-дихлорфеноліндофенолом і відновленні аскорбіновою кислотою

D. В утворенні з 2-тіобарбітуровою кислотою забарвленого триметинового комплексу

E. В утворенні забарвлених продуктів з оксиметилфурфуролом

2. Вказати вміст загальних фосфоліпідів за умов норми:

А. 1, 52-3, 62 г/л

В. 0, 25-1, 25 г/л

С. 3, 75-5, 40 г/л

Д. 10, 15-12, 30 г/л

Е. 9, 80-15, 72 г/л

3. При лабораторному обстеженні у хворого виявили стеаторею. Вкажіть фермент, недостатність дії якого призвела до виникнення цього симптому?

А. Ліпаза

В. Пепсин

С. Лактаза

Д. Амілаза

Е. Хімотрипсин

4. Людина тривалий час обмежує вживання продуктів, що містять фосфоліпіди. До яких метаболічних порушень це може призвести?

5. При аналізі сироватки крові людини знайдено 5 ммоль/л загального холестеролу, 3, 2 ммоль/л фосфоліпідів, 1, 5 ммоль/л тригліцеридів. Чи відповідають ці показники нормі? Як називається такий стан і коли він буває?

6. Концентрація фосфоліпідів у крові становить 0, 7 г/л. Як називається такий стан і про які метаболічні порушення свідчить?

Приклади тестів „Крок-1”

1. Потерпілий від укусу гадюки ледь не помер внаслідок інтенсивного гемолізу. Аналіз крові показав незвично високий вміст лізолецитину. Токсичний ефект був обумовлений наявністю у зміїній отруті:

А. Фосфоліпази А₁

В. Фосфоліпази А₂

С. Фосфоліпази С

Д. Фосфоліпази Д

Е. Нейрамінідази

2. У хворих на цукровий діабет спостерігається підвищення вмісту вільних жирних кислот. Причиною цього може бути:

А. Накопичення в цитозолі пальмітоїл-КоА

В. Активація утилізації кетонових тіл

С. Активація синтезу аполіпопротеїнів А₁, А₂, А₄

Д. Зниження активності фосфатидилхолінхолестеринацилтрансферази плазми крові

Е. Підвищення активності тригліцеридліпази

3. При лабораторному обстеженні крові хворого, взятої натще, виявлено, що сироватка має білуватий колір, вміст загальних ліпідів – 20 г/л, холестеролу – 9 мМ/л. Після центрифугування сироватки на поверхні утворюється біла плівка, що дозволяє припустити збільшення в крові хіломікронів. Зниження активності якого ферменту може спричинити таке явище?

А. Ліпази підшлункової залози

В. Панкреатичних фосфоліпаз

С. Лецитинхолестерол-ацилтрансферази

Д. Ліпази жирової тканини

Е. Ліпопротеїнліпази крові

4. Внаслідок тривалого вживання жирної їжі у хворого розвинулася аліментарна гіперліпемія, яка головним чином може бути наслідком підвищення вмісту:

А. Фосфоліпідів

В. Холестеролу

С. Гліколіпідів

Д. Хіломікронів

Е. Тригліцеридів

5. Після прийому жирної їжі у хворого з’являються нудота та печія, має місце стеаторея. Причиною такого стану може бути:

А. Недостатність амілази

В. Підвищення виділення ліпази

С. Порушення синтезу фосфоліпази

Д. Порушення синтезу трипсину

Е. Недостатність жовчних кислот

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Метаболізм сфінголіпідів в нормі та при патології; клінічне значення, порушення обміну сфінголіпідів.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.72-85, 190-194, 209-216.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.213-228, 348-365, 378-381, 382-384.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С.276-291, 305-309.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.87-106.

5. Клінічна біохімія. / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2006. – С.63-79.

6. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2007. – С.102-111.

Додаткова:

1. Асинова М.И., Белая И.И. Липидный обмен и социальная адаптация человека при старении // Клин. геронтология. – 2001. – № 7. – С. 18-22.

2. Красильников О.А. Роль ионов Са в реализации быстрых эффектов L-тироксина на обмен фосфоинозитидов в клетках печени крыс / Биохимия. – 2003. – Т. 68, № 7. – С. 946-953.

Тема № 6. β -Окиснення та біосинтез жирних кислот. Дослідження обміну жирних кислот та кетонових тіл.

Мета заняття: Вивчити процеси біосинтезу та окиснення жирних кислот. Знати метаболізм кетонових тіл в нормі та при патології і вміти визначати їх вміст у сечі.

Актуальність теми: Окиснення ліпідів та метаболізм кетонових тіл є важливою складовою метаболізму, що забезпечує організм людини резервами метаболічного палива у вигляді енергії АТФ. Визначення вмісту кетонових тіл в крові та сечі має важливе значення для діагностики ряду патологічних процесів.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати β -окиснення вищих жирних кислот.

Ø Трактувати біосинтез вищих жирних кислот та регуляцію процесу біосинтезу на рівні ацетил-КоА-карбоксилази та на рівні синтетази жирних кислот.

Ø Аналізувати метаболізм кетонових тіл.

Ø Пояснювати механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні.

Теоретичні питання

1. β -Окиснення вищих жирних кислот:

· локалізація процесу β -окиснення жирних кислот;

1. активація жирних кислот. Роль карнітину в транспорті жирних кислот в мітохондрії;

2. послідовність ферментативних реакцій β -окиснення жирних кислот;

3. енергетика β -окиснення жирних кислот.

2. Механізм окиснення гліцеролу, енергетика цього процесу.

3. Біосинтез вищих жирних кислот:

· локалізація біосинтезу вищих жирних кислот;

· метаболічні джерела синтезу жирних кислот;

· стадії синтезу насичених жирних кислот;

· характеристика синтетази ВЖК, значення ацилтранспортуючого білка, біотину;

· джерела НАДФН, необхідного для біосинтезу жирних кислот;

· послідовність ферментативних реакцій біосинтезу вищих жирних кислот;

· регуляція процесу біосинтезу на рівні ацетил-КоА-карбоксилази та на рівні синтетази жирних кислот;

· елонгація насичених жирних кислот;

· утворення ненасичених жирних кислот.

4. Метаболізм кетонових тіл:

· ферментативні реакції біосинтезу кетонових тіл;

· реакції утилізації кетонових тіл, енергетичне значення;

· метаболізм кетонових тіл в умовах патології. Механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні;

· поняття – кетоацидоз, кетонемія, кетонурія.