Практична робота. Дослід 1. Якісна реакція на жовчні кислоти (реакція Петенкофера)

Дослід 1. Якісна реакція на жовчні кислоти (реакція Петенкофера)

Принцип методу. Реакція базується на утворенні забарвлених продуктів конденсації у разі взаємодії жовчних кислот з оксиметилфурфуролом. Останній утворюється з фруктози, що є продуктом гідролізу внаслідок додавання до сахарози концентрованої сульфатної кислоти.

Матеріальне забезпечення: жовч, 20 % розчин сахарози, концентрована Н₂SO₄, пробірки.

Хід роботи. У пробірку наливають 10-15 крапель жовчі, додають 1 краплю свіжого розчину сахарози і злегка струшують. В іншу пробірку вміщують 10-15 крапель сульфатної кислоти. Розчин, що містить жовч, обережно, по стінках, нашаровують на сульфатну кислоту. На межі розподілу рідин утворюється осад жовчних кислот і з’являється червоно-фіолетове кільце. У разі легкого струшування рідина набуває вишнево-червоного забарвлення.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Головним емульгатором ліпідів є жовч, яка містить жовчні кислоти, що утворюються в печінці (10-15 г за добу). До них належать: холева, дезоксихолева, хенодезоксихолева, літохолева та інші, які виділяються з жовчю у вільному стані та у вигляді парних жовчних кислот, які зв’язані з гліцином або з таурином. Жовчні кислоти емульгують ліпіди, активують панкреатичну ліпазу, беруть активну участь у процесі всмоктування жирних кислот, утворюють холеїнові комплекси, стабілізують холестерол. Дефіцит жовчі в кишківнику може бути пов’язаний із захворюваннями печінки (механічна жовтяниця, гепатити, цироз), жовчного міхура або жовчних шляхів (жовчокам’яна хвороба, пухлини жовчовивідних шляхів). При копрологічних дослідженнях спостерігають зменшення або відсутність у калі жовчних пігментів (ахолічний кал) та високий вміст мил, особливо кальцієвих.

Дослід 2. Визначення процесів ліпідної пероксидаціі в тканинах. Визначення вмісту малонового діальдегіду.

Принцип методу. Метод ґрунтується на тому, що за високої температури в кислому середовищі малоновий діальдегід (МДА) реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) з утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання при 532 нм.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, фосфатний буфер рН 7, 4; 1мМ KMnO₄, 1 мМ FeSO₄, 20 % розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК), 1н хлоридна кислота, 0, 7 % тіобарбітурова кислота, бутанол, центрифуга, водяна баня, спектрофотометр, пробірки.

Хід роботи. До 3 мл фосфатного буфера (рН 7, 4) додають 0, 2 мл сироватки; 0, 5 мл 1мМ KMnO₄, перемішують, а через 10 хв додають 0, 5 мл 1 мM FeSO_4. Після цього додають 1 мл 20 % ТХАК і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. Далі до 2 мл супернатанту додають 0, 5 мл 1н НСІ та 1 мл 0, 7 % тіобарбітурової кислоти. Суміш витримують 20 хв на киплячій водяній бані (95-100°С). Після різкого охолодження в пробірку вносять 3 мл бутанолу, ретельно перемішують розчин і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв.

Оптичну густину розчину визначають спектрофотометрично при 532 нм. Вміст МДА виражають в мкМ/мл сироватки.

Розрахунок проводять за формулою:

С = А × 52, 88 / 0, 2,

де А – оптична густина розчину;

52, 88 – коефіцієнт перерахунку;

0, 2 – кількість мл сироватки крові в пробі.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Утворення вільних радикалів та продуктів ПОЛ є необхідною ланкою нормального метаболізму, що корелює з активністю мембранозв’язаних електронтранспортних та енерго-трансформуючих систем, сприяє оновленню клітинних мембран, бере участь у регуляції активності мембранозв’язаних ферментів, біосинтезі простагландинів, лейкотрієнів, піноцитозі.

Вміст МДА (ТБК-активних продуктів) у крові здорових людей становить 6, 2-8, 3 мкмоль/л. Надмірна інтенсифікація ПОЛ призводить до порушення перебігу хімічних процесів, клітин і наростання системної поліорганної патології. Збільшення вмісту МДА спостерігається при атеросклерозі, ішемічній хворобі серця та печінки, гіпертонічній хворобі, під впливом іонізуючого опромінення, а також під час старіння. Зниження вмісту МДА спостерігається при хронічній серцевій недостатності, онкологічних захворюваннях, тощо.

Дослід 3. Вивчення системи антиоксидантного захисту. Кількісне визначення активності каталази в крові.

Принцип методу. Метод визначення активності каталази базується на визначенні кількості пероксиду водню, перетвореного ензимом за певний проміжок часу.

Матеріальне забезпечення: розведена кров (1: 1000), дистильована вода, 1% розчин Н₂О₂, 10 % розчин сірчаної кислоти, 0, 1 н розчин КМпО₄, колби, піпетки, бюретка.

Хід роботи. Розведену кров (1: 1000) наливають по 1 мл в дві колбочки, додають по 7 мл дистильованої води, в дослідну пробу додають 2 мл 1 % Н₂О₂, а в контрольну – 5 мл 10 % розчину сірчаної кислоти. Дія каталази в кислому середовищі припиняється (в контрольній пробі), так як вона діє при рН 7, 4. Колбочки залишають на 30 хв при кімнатній температурі. Потім до дослідної проби додають 5 мл 10 % розчину сірчаної кислоти. А до контрольної – 2 мл 1% розчину Н₂О₂. Вміст колбочок титрують 0, 1 н розчином КМnО₄ до рожевого забарвлення.

Каталазне число (Кч) розраховують за формулою:

Кч = (А – В) ´ 1, 7

де: А – кількість мл 0, 1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування контрольної проби;

В – кількість мл 0, 1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування дослідної проби.

В нормі каталазне число становить 10-15 одиниць.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Антиоксидантні реакції у механізмі захисних процесів організму є провідними і найбільш потужними, оскільки вони не тільки запобігають розвитку вільнорадикальних реакцій, але й забезпечують ефективність елімінації кінцевих метаболітів пероксидного окиснення із залученням їх до енергетичного обміну, тим самим підтримуючи високу активність синтетичних процесів, у тому числі ензимів супероксиддисмутази (СОД), каталази та глутатіонпероксидази (ГПО), які відповідно формують другий і третій ступені захисту. Крім запобігання нагромадженню пероксидів, такий антиоксидантний захист стабільно підтримує високу активність окисно-відновних процесів внаслідок утворення кисню при перетворенні супероксиду в пероксид за участю СОД і гідролізу його каталазою та глутатіонпероксидазою.

У нормі інтенсивність процесів ПОЛ регулюється системою антиоксидантного захисту. Найважливішими компонентами антирадикального і антипероксидного захисту є ензими, які каталізують реакції між активованими формами кисню, здійснюють розпад гідропероксидів. Серед цих ензимів важливе місце займає каталаза, яка прискорює реакцію розщеплення пероксиду водню та деяких його однозаміщених похідних.

В нормі активність каталази в крові людини 25, 5-52, 2 мкат/л. Підвищення активності каталази спостерігається при хронічній серцевій недостатності, перціозній анемії та макроцитарних анеміях, при введені в організм кофеїну, алкоголю, ацетонових тіл. Зниження активності цього ензиму спостерігається при злоякісних пухлинах, при ряді інфекційних захворювань (черевний тиф, скарлатина, малярія, туберкульоз легень).

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Якою якісною реакцією можна виявити жовчні кислоти в біологічних рідинах?

А. Реакція Петенкофера

В. Біуретова реакція

С. Проба Ланге

Д. Бензидинова проба

Е. Реакція Фоля

2. У хворого хлопчика 12 років вміст холестеролу у сироватці крові становить 25 ммоль/л. В анамнезі – спадкова сімейна гіперхолестеринемія, причиною якої є порушення синтезу білків-рецепторів до:

А. Ліпопротеїнів низької щільності

В. Ліпопротеїнів проміжної щільності

С. Хіломікронів

Д. Ліпопротеїнів дуже низької щільності

Е. Ліпопротеїнів високої щільності

3. За активністю яких ензимів оцінюють надійність антиоксидантного захисту?

А. Супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, каталази

В. Аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази

С. Ліпази, фосфоліпази, холестеролестерази

Д. Пепсину, трипсину, хімотрипсину

Е. Лужної та кислої фосфатази

4. Про що може свідчити підвищена концентрація малонового діальдегіду у сироватці крові хворих?

А. Активацію ПОЛ і руйнування клітинних мембран

В. Збільшення кількості вітаміну Е

С. Підвищення активності ензимів антиоксидантного захисту

Д. Зниження вмісту дієнових кон’югатів

Е. Збільшення вмісту вітаміну С

5. Вміст холестеролу в крові складає 12 ммоль/л. Дати клінічну інтерпретацію результату, вказати можливі причини і наслідки для організму.

6. Вітамін Е відіграє важливу роль у системі антиоксидантів, проявляє стабілізуючий вплив на стан біліпідного шару мембран. На чому ґрунтується його дія?

Приклади тестів „Крок-1”

1. При обстеженні хворого виявлено підвищений вміст ліпопротеїнів низької щільності в сироватці крові. Яке захворювання можна очікувати у цього хворого?

А. Запалення легень

В. Атеросклероз

С. Гастрит

Д. Гострий панкреатит

Е. Ураження нирок

2. Скарги та об’єктивні дані дозволяють припустити наявність у хворого запального процесу у жовчному міхурі, порушення колоїдних властивостей жовчі, ймовірність утворення жовчних каменів. Що головним чином може спричинити їх утворення?

А. Урати

В. Оксалати

С. Хлориди

Д. Фосфати

Е. Холестерин

3. Посилення пероксидного окиснення ліпідів та біополімерів є одним із основних механізмів пошкодження структури та функції клітинних мембран і загибелі клітини. Причиною цього є:

А. Гіповітаміноз В₁

В. Гіпервітаміноз В₁

С. Гіповітаміноз В₁₂

Д. Гіпервітаміноз В₁₂

Е. Гіповітаміноз Е

4. В процесі лікування пародонтозу застосовують антиоксиданти природного та штучного походження. Вкажіть, яка з наведених природних сполук використовується в якості антиоксидантного засобу?

А. Тіамін

В. Глюконат

С. Піридоксин

Д. Холін

Е. Токоферол

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Пероксидне окиснення ліпідів.

2. Реалізація біохімічної ролі оксиду азоту.

3. Антиоксидантна система, її значення.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.217-233.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.363-364, 381-396.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С.309-317.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.87-106.

5. Клінічна біохімія. / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2006. – С. 63-81.

6. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2007. – С.102-111.

Додаткова:

1. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 469 с.

2. Малюкова Н. Г. Возрастные особенности состояния перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы при хронической сердечной недостаточности // Проблемы старения и долголетия. – Т. 14, № 2. – 2005. – С. 143 – 150.

3. Янькова В.И. Возрастные изменения липидного спектра уровня пероксидации липидов и антиоксидантной защиты крови и печени крыс // Рос. физиол. журнал. – Т. 89, № 7. – 2003. – С. 828 – 836.

Тема № 8. Дослідження перетворень амінокислот (трансамінування, дезамінування, декарбоксилування), біосинтезу глутатіону та креатину.

Мета заняття: Вивчити загальні шляхи перетворення амінокислот, оволодіти методами ідентифікації їх метаболітів. Вміти інтерпретувати отримані показники.

Актуальність теми: Обмін білків є центральною ланкою всіх біохімічних процесів, знання і розуміння загальних шляхів перетворень амінокислот, їх метаболітів та визначення активності ферментів, що беруть участь у цих перетворення є критеріями для оцінки обміну білків.

Конкретні завдання:

Ø Визначати активність амінотрансфераз у сироватці крові динітрофенілгідразиновим методом;

Ø Оволодіти методом кількісного визначення креатиніну в сироватці крові;

Ø Давати оцінку проведеним дослідженням і робити висновки про можливість їхнього використання у клінічній практиці.

Теоретичні питання

1. Шляхи утворення та підтримання пулу вільних амінокислот в організмі людини.Загальні шляхи перетворення вільних амінокислот.

2. Трансамінування амінокислот, субстрати для реакцій транс амінування. Механізм реакції трансамінування. Трансамінази. Локалізація трансаміназ в органах і тканинах. Клініко-діагностичне значення визначення активності трансаміназ.

3. Типи реакцій дезамінування амінокислот і їх кінцеві продукти. Механізм окиснювального дезамінування амінокислот. Оксидази L- і D-амінокислот. Їх ферментативна активність, специфічність дії.

4. Декарбоксилування амінокислот. Декарбоксилази. Утворення біогенних амінів (g-аміномасляна кислота, гістамін, серотонін, дофамін). Декарбоксилування амінокислот у процесі гниття білків у кишківнику. Окиснення біогенних амінів.

5. Глутатіон, будова та роль в обміні органічних пероксидів.

6. Утворення креатину та креатиніну, клініко-біохімічне значення порушень їхнього обміну.