Метафазний тест

Аналіз хромосом соматичних клітин в метафазу мітозу методично добре розроблений. Метод інформативний, так як:

- Каріотип багатьох організмів добре вивчений,

- У метафазу видно весь геном цілком безпосередньо за допомогою мікроскопічного аналізу,

- Метод досить короткостроковий і економічний,

- У метафазу хромосоми добре видно.

Метафазний аналіз проводиться в клітинах які діляться мітотично. Метафазний аналіз є обов'язковим компонентом систем, призначених для перевірки факторів зовнішнього середовища на мутагенну активність.

Принцип методу.Для цілей тестування використовують мікро- і напівмікрометод. Периферичну кров людини поміщають в живильне середовище, що містить все необхідне для життя і розмноження клітин поза організмом. У культуру додають стимулятор мітозів фітогемагглютинін (ФГА). В результаті лейкоцити вступають в мітоз. Далі культуру піддають дії досліджуваного фактора. Клітини інкубують при 37 градусах протягом 72 годин. За 6 годин до кінця інкубації в культуру додається колхіцин або кальцимід, які перешкоджають утворенню ахроматинового веретена поділу і сприяють спіралізації хромосом. В результаті ділення клітини зупиняється на стадії метафази. Це призводить до накопичення метафазних клітин в культурі. Через 72 години інкубації культуру центрифугують. Осілі на дно пробірки клітини обробляють гіпотонічним розчином хлористого калію або цитрату натрію. Це призводить до набухання клітин і полегшує розходження хромосом на цитологічному препараті. Потім гіпотонічний розчин прибирають центрифугуванням, клітини фіксують (фіксатор: 3 частини метилового спирту і одна частина крижаної оцтової кислоти). Суспензію клітин наносять на предметне скло, випалюють фіксатор. Препарат забарвлюють. Для генотипічних досліджень використовується так зване рівномірне фарбування за Романовським-Гімза [Філенко, 2007].

Для генотоксичного аналізу не потрібно проведення каріотипування, про мутагенну активність судять по частоті хромосомних аберації. Визначають: загальне число проаналізованих клітин, кількість клітин з абераціями хромосом, загальне число пошкоджених хромосом і типи аберації. Про мутагеність фактора судять, порівнюючи ці показники в контрольному і дослідному варіантах.

Даний метод є більш точним в порівнянні з ана-телофазним методом, проте придатний тільки для об'єктів, для яких вже ідентифіковані всі хромосоми, визначений каріотип. Він також більш складний і вимагає високої кваліфікації дослідника [Кондратенко, 1999].