Флуоресцентный анализ.

1. Белок вызывает флуоресценцию АНС. Если концентрацию белка увеличить до прибавления АНС, флуоресценция понижается. Дать два возможных объяснения понижению флуоресценции.

2. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами. Известно, что белок содержит только один триптофан, флуоресценция которого не тушится иодид-ионами. Каковы возможные объяснения отсут­ствия тушения?

3. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами. Известно, что белок содержит восемь триптофановых остатков и иодид-ионы тушат 25% флуоресценции. Напрашивается предположение, что два триптофановых остатка доступны растворителю. Укажите несколько фактов, которые могли бы сделать это заключение необоснованным.

4. Когда образуются эксимеры, их спектр возбуждения совпадает со спектром мономера, потому что мономер возбуждается до димеризации. Если присутствует много димеров и димер возбуждается, можно ли ожидать, что спектр возбуждения будет соответствовать спектру поглощения мономера? Поясните.

5. Интенсивность флуоресценции понижается вследствие тушения иодид-ионом. Можно ли ожидать также изменения формы спектров возбуждения и испускания?

6. Дайте описание нескольких возможных механизмов возрастания квантового выхода флуоресцирующего хромофора при связывании с ним другой молекулы. Почему иногда могут быть сдвиги спектров возбуждения (или испускания) или обоих вместе? Происходит ли сдвиг в сторону длин­ных или коротких длин волн?

7. Всегда ли спектр возбуждения флуоресцирующего хромофора такой же, как спектр поглощения? Поясните.

8. Белок, содержащий десять триптофановых остатков, имеет сильную триптофановую флуоресценцию. Маленькая молекула, способная прочно свя­зываться с белком, фактически не изменяет его флуоресценции, хотя изве­стно, что в участке связывания имеется два триптофановых остатка. Дайте несколько возможных объяснений этому.

9. Когда флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый связывается с ДНК и смесь облучается светом, который поглощается акридиновым оранжевым, в ДНК происходят необратимые химические изменения (например, разрушаются пуриновые кольца, рвутся одноцепочечные спиральные структуры). Чтобы происходили эти изменения, необходимо присутствие молекулярного О2; поэтому этот процесс называется фотосенсибилизирован-ным окислением или фотоокислением. Такие реакции происходят со многими акридиновыми производными; эффективность реакции приблизительно пропор­циональна квантовому выходу флуоресценции. Предложите механизм фотоокисления.

10. Флуоресцирующий хромофор ковалентно присоединен к белку. Измерена поляризация флуоресценции в зависимости от ионной силы буфера, в котором суспендирован белок; найдено, что она заметно уменьшается по мере возрастания ионной силы. Как влияет на белок возрастание ионной силы?

11. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Иодид-ион тушит флуоресценцию F, а не триптофана.

12. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Иодид-ион тушит флуоресценцию F и триптофана.

13. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Доведение рН до 9 приводит к исчезновению флуоресценции F и увеличению флуоресценции триптофана (допустим, что отсутствует влияние рН на свободный триптофан или несвязанный F).

14. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Доведение рН до 9 приводит к исчезновению флуоресценции триптофана и заметному увеличению флуоресценции F.