Настройка освещения по методу Кёлера.

1. Установить контрастный образец на предметный стол

2. Ввести в ход лучей объектив

3. Получить резкое изображение объекта, используя макро- и микровинты микроскопа при прикрытой полевой диафрагме

4. Движением конденсора по вертикальной оси получить резкое изображение края полевой диафрагмы

5. Отцентрировать полевую диафрагму относительно поля, используя центрировочные винты конденсора

6. Открыть полевую диафрагму до края поля зрения

7. Извлечь окуляр

8. Открыть апертурную диафрагму до диаметра выходного зрачка объектива (по размеру светящегося диска)

9. Для большего контрастирования прикрыть апертурную диафрагму примерно на 2/3 выходного зрачка объектива

10. Вернуть окуляр.

При отдалении конденсора от препарата усиливаются аберрации, при уменьшении апертуры конденсора снижается разрешение, но увеличивается контрастность изображения. Дело в том, что в микроскопе числовая апертура системы равна полусумме числовых аппертур конденсора и объектива. В случае флуоресцентной микроскопии, где объектив также исполняет роль конденсора числовая апертура системы, очевидно, равна числовой апертуре объектива.

Метод темного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив: при отсутствии объекта поле зрения микроскопа будет темным, а при его наличии – контрастный светлый объект будет виден на темном фоне в рассеянном свете.

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют:

специальный конденсор темного поля, или упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмированием центра осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объектива (при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму, или вкладыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива, приближая его к осветительной апертуре, оптимальной для получения эффекта темного поля).

Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903г.

Метод фазового контраста. Метод связан с изменением условий освещения при наблюдении слабоконтрастных биологических объектов (микроорганизмов, растительных клеток) в неокрашенном состоянии с целью их визуализации (контрастирования).

В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные.

Фазовые объективы внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет ¹/₂-²/₃ от диаметра выходного зрачка объектива, при этом светопропускание кольца – 10-30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернее его изображение, подбирается так, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива. В современных микроскопах существует два способа установки световых пластин в конденсор:

– в плоскость апертурной диафрагмы конденсора устанавливается съемный вкладыш для соответствующего объектива (обычно это черная пластмассовая деталь с прорезанным световым кольцом);

– используется револьверное устройство, закрепленное на конденсоре; имеется несколько гнезд: одно пустое – для светлого поля, и 3-4 гнезда со стеклянными пластинами, на которых с помощью маски получено световое кольцо.

Исследование в поляризованном свете. Метод связан с визуализацией объекта или его элементов в результате изменения направления поляризации света и проявления анизотропных свойств объекта. Особенностью микроскопа является наличие в оптической схеме поляризационных фильтров: в осветительной части – поляризатора, а в промежутке между объективом и окуляром – анализатора. Наблюдение производится тогда, когда оси поляризации обоих фильтров взаимно перпендикулярны, при этом в выходном зрачке объектива наблюдается максимальное затемнение. При внесении объекта, обладающего оптической активностью, изменяется плоскость поляризации световых волн, и его изображение проходит через анализатор.

Дифференциально-интерференционный контраст (DIC). Этот метод применяется для визуализации объектов с минимальными различиями по величине фазовых сдвигов в объекте. Часто для осуществления этого метода используются поляризационные призмы. На пути предварительно поляризованного света перед конденсором устанавливается призма Волластона, расщепляющая свет на два пучка. Величина расхождения пучков в плоскости препарата по порядку величины соответствует разрешающей способности объектива. Поскольку эти пучки проходят через разные участки препарата, то между ними возникает разность фаз. За объективом тоже располагается призма Волластона, которая объединяет эти пучки и с помощью анализатора создает условия для интерференции обоих пучков. При этом получается раздвоенное изображение объекта, и разность фаз преобразуется в разность интенсивностей так, что объект представляется рельефным. Поскольку величина расщепления пучков не превышает разрешающей способности объектива, то это сдвоенное изображение мы наблюдаем, как единичное. При реализации метода DIC в отраженном свете применяется единственная двоякопреломляющая линза Номарского. Дополнением метода DIC может служить лямбда-пластина, которая преобразует градации серого, видимые как разность рельефа, в различные цвета.