Флуоресценция

Флуоресценция является одной из разновидностей более общего явления – люминесценции. Люминесценцией называется эмиссия ультрафиолетового, видимого или инфракрасного фотона из возбужденного вещества. Слово пришло из латинского языка (lumen=свет) было впервые предложено как luminescenz физиком и историком науки Eilhardt Wiedemann в 1888 году для описания «всех тех феноменов света, которые определяются не только ростом температуры, в противоположность накаливанию. Люминесценция – это «холодный свет», тогда как накаливание – «горячий свет». В соответствии с типом возбуждения классифицируются различные виды люминесценции (табл.1).

Табл.1.

Рис.16.Диаграмма Яблонского. При возбуждении флуорофора квантом света электрон переходит из основного состояния S0 в возбужденное S1, 2. Часть энергии рассеивается в виде тепла (переход S2-S1, переходы между колебательными подуровнями). В дальнейшем электрон может занять один из колебательных подуровней S0 с испусканием кванта света (флуоресценция), без испускания кванта света (безызлучательная релаксация), или совершить синглет-триплетный переход. При триплет-синглетном переходе электрон может занять энергетический подуровень S0, испуская квант света (фосфоресценция), или S1 с последущим испусканием кванта при переходе S1-S0 (замедленная флуоресценция).

Итак, флуоресценция возникает, когда вещество – флуорофор, находясь в возбужденном состоянии, испускает фотон. Проиллюстрировать эту ситуацию помогает диаграмма Яблонского (рис.16). Известно, что электроны, находящиеся на внешней оболочке молекул вещества в основном состоянии S₀, при взаимодействии с фотоном могут переходить в состояние с более высоким значением энергии - возбужденное состояние S₁. При этом энергия фотона в точности равна разности энергий основного и возбужденного состояний. Часть энергии фотона рассеивается в виде тепла при переходе между колебательными подуровнями возбужденного состояния, пока электрон не окажется на подуровне с наименьшей энергией. После этого электрон может перейти обратно на один из колебательных подуровней основного состояния S₀. При этом происходит испускание фотона флуорофором. Рассмотренный пример описывает механизм флуоресценции.

Рис.17.Стоксовское смещение.Спектры возбуждения и флуоресценции (эмиссии) кальциевого флуоресцентного красителя Rhod-2. Спектр эмиссии флуорофора смещен относительно спектра возбуждения в красную область спектра.

Очевидно, что излучаемый фотон имеет меньшую энергию (большую длину волны), чем фотон поглощенный, поскольку часть поглощенной энергии была израсходована в виде тепла. Таким образом, если рассматривать спектр эмиссии (флуоресценции) данного флуорофора, то он будет смещен относительно спектра возбуждения (поглощения) в красную область. Это смещение называется Стоксовским сдвигом (рис.17). Каждый флуорофор имеет свой специфический спектр возбуждения (экстинкции) и флуоресценции (эмиссии).

В настоящее время явление флуоресценции широко используется в биологических исследованиях. Синтезировано огромное количество флуоресцентных меток, избирательно связывающихся с компонентами клеток, а также позволяющих отслеживать динамику различного рода параметров живых объектов во времени (таких как концентрации различных катионов, pH, движение органелл и др.). Суть флуоресцентных исследований сводится к внесению флуоресцентной метки (зонда) в живой или фиксированный объект и дальнейшая визуализация этого зонда с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. При этом методы регистрации флуоресценции можно рассматривать как один из методов контрастирования, позволяющий визуализировать структуры, которые не видно в обычном микроскопе проходящего света.