Конфокальный микроскоп

Традиционная флуоресцентная микроскопия дает хорошие результаты при исследовании тонких объектов. Если же попытаться заглянуть в толщу препарата, изображение теряет контраст и становится размытым. Это происходит из-за того, что свет, отраженный материалом выше и ниже интересующей наблюдателя плоскости, тоже попадает на детектор. Чтобы добиться четкой картины отдельной плоскости в толще образца, необходимо собрать свет только с этой плоскости. Еще в 1961г. Марвин Мински запатентовал «сканирующий микроскоп с двухстадийной фокусировкой». Действие его было основано на следующем принципе: сфокусированный объективом в одну точку свет направлялся на интересующий участок образца. С помощью вращающегося Нипков диска с мельчайшими отверстиями свет последовательно фокусировался на разных точках исследуемой плоскости образца. Для того, чтобы избавиться от паразитного сигнала из участков вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма с крошечным отверстием, расположенная в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива таким образом, что если диафрагму спроецировать на объект, то ее изображение точно совпало бы с фокусом освещающего объект света (отсюда и название «конфокальный» - основанный на сопряжении фокусов). В результате сканирования плоскости по точкам строилось изображение на фотопленке. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой, а на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Но на изображении получалось слишком много помех из-за слабого освещения, ручной настройки и малой скорости сканирования. В конце 80-x годов с совершенствованием техники удалось решить эти проблемы.

Принцип работы современного конфокального микроскопа (рис.27).

Рис.27.Схема конфокального микроскопа.

Источник света – лазер излучает возбуждающий свет, который проходит через возбуждающую диафрагму (excitation pinhole), формируя узкий пучок. Свет проходит через возбуждающий фильтр и попадает на светоделитель, как и в случае флуоресцентной микроскопии. Светоделитель отражает возбуждающий свет, направляя его на сканирующий гальванометр, представляющий собой систему зеркал, позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. Излученный флуорофором свет собирается объективом, и возвращается на светоделитель, но на этот раз не отражается, а проходит сквозь него. После светоделителя свет попадает на эмиссионные фильтры. При многоканальной регистрации возможно дополнительное разделение света флуоресценции на разные спектральные составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Так или иначе, свет, собранный из точки образца, фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole). Из схемы видно, что свет, исходящий из областей выше или ниже плоскости фокуса не проходит через конфокальную диафрагму. Тот свет, которому удалось пройти сквозь конфокальное отверстие, попадает на детектор – фотоэлектронный умножитель. После этого уже электрический сигнал с детектора подвергается оцифровке с помощью аналого-цифрового преобразователя. Информация об интенсивности флуоресценции в данной точке образца сохраняется в памяти компьютера. Далее система зеркал направляет луч возбуждающего света на соседнюю точку в образце и процесс повторяется. Так точка за точкой формируются горизонтальные и вертикальные ряды изображения, которое выводится на монитор в виде растровой картинки. Интенсивность каждого пикселя этого изображения соответствует интенсивности флуоресценции соответствующих точек на образце.

Итак, конфокальный микроскоп позволяет выделить из всей толщи образца плоскость и зафиксировать ее контрастное изображение. Если, перемещая образец вдоль аксиальной оси с известным шагом получить серию оптических срезов, так называемый Z-stack, можно программными алгоритмами воссоздать на компьютере трехмерную структуру образца. Эта возможность является главным достоинством конфокальной микроскопии. Таким способом можно исследовать пространственную организацию различных клеточных компонентов и органелл.

Рис.28. Изображения объекта, полученные с использованием обычной флуоресцентной микроскопии и с применением конфокальной схемы.

Разрешение в конфокальном микроскопе. Схема конфокального микроскопа не может помочь в преодолении дифракционного предела разрешения. Но, реализация такой схемы помогает добиться значительного увеличения контраста изображения.

Изображение точечного светящегося объекта в обычном микроскопе представляется как дифракционная картина – центральное пятно (диск Эйри), окруженное чередующимися светлыми и темными кольцами. При этом, любой точечный объект размывается, и изображение точки в результате дифракции перекрывается с изображением от соседней точки. В конфокальном микроскопе, установив диаметр конфокальной диафрагмы равным одному диску Эйри, можно избавиться от ухудшающих контрастность изображения колец. На детектор попадает только свет, соответствующий центральному пятну дифракционной картины точечного объекта. При этом контрастность в латеральной плоскости повышается примерно в 1, 4 раза, в сравнении с обычными микроскопами. Усиление контраста позволяет выявить дополнительные детали изображения, которые маскируются размытием точек в обычной микроскопии (рис.28). По критерию Рэлея латеральное разрешение в конфокальном микроскопе равно 0, 44l/NA, когда для обычного микроскопа эта величина составляет 0, 61l/NA. Современные методы производства оптики, вместе с конфокальной схемой позволяют получать микроскопические изображения с максимальным теоретическим разрешением, то есть разрешать точки, находящиеся на расстоянии около 200нм.

Но главное преимущество конфокальной микроскопии, позволяющее прижизненно получить информацию о трехмерной структуре объекта без необходимости трудоемкой фиксации и подготовки тонких срезов, является сильно увеличенная разрешающая способность по аксиальной оси. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа находится по формуле:

l _min=1.4l× n /NA²,

где l - длина волны света; n - коэффициент преломления иммерсионной среды; NA – числовая апертура объектива.

Рис.29. Функция рассеивания точки в обычной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. По горизонтали – ось Х, по вертикали ось Z.

Видно, что числовая апертура объектива здесь вносит значительно больший вклад в разрешающую способность, чем длина волны света. На рисунке представлено изображение функции рассеивания точки (PSF – point spread function) в плоскости XZ, для случая флуоресцентной (слева) и конфокальной (справа) микроскопии. Видно значительное увеличение разрешения по аксиальной оси. Конфокальный микроскоп позволяет получать тонкие контрастные оптические срезы флуоресцирующего объекта, при этом свет из соседних точек вне фокальной плоскости, задерживается конфокальной диафрагмой, в отличие от традиционной флуоресцентной микроскопии.

Моды сканирования. Поскольку в конфокальной микроскопии реализуется процесс сканирования, имеется возможность проводить это сканирования по разным осям. Применяются следующие моды сканирования.

XY. Это сканирование единичного двумерного изображения. Сканирующий луч движется в одной плоскости.

XYZ. Такое сканирование применяется если надо получить информацию от трехмерной организации исследуемого объекта. Сначала получается изображение объекта в одной плоскости. Затем, перемещением предметного столика по аксиальной оси, сканируется соседняя плоскость и так далее. В результате получается набор оптических срезов исследуемого образца – Z-stack. Зная расстояние между срезами по оси Z с помощью специальных программных алгоритмов можно воссоздать трехмерную структуру объекта.

XYT-сканирование применяется при исследовании динамики клеточных процессов. Здесь единичные изображения XY захватываются через определенные промежутки времени. В результате получается временная серия изображений. Здесь изменения в изображении (перемещение объектов или изменение уровня флуоресценции) дают информацию об изменяющихся параметрах клеток.

XYZT. Применяется когда надо проследить изменение трехмерной организации меченых объектов во времени. Через равные промежутки времени снимается Z-серия.

XT. Эта мода сканирования применяется для исследования очень быстрых процессов с высоким разрешением по времени. При этом сначала получают двумерное изображение, на котором проводится линия интереса. После запуска XT сканирование будет проводиться только по этой линии непрерывно. На мониторе каждый последующий проход по линии подставляется под предыдущий. Таким образом, получается двумерное изображение, где по оси X-координата вдоль линии интереса, а по оси Y – временная координата начала сканирования каждой линии. Сканирование этим методом позволяет получать до 1000 линий в секунду.

Спектральное сканирование (лямбда-скан). Современные конфокальные микроскопы позволяют исследовать свет флуоресценции в узкой (до 5нм) области спектра. Это позволяет снимать спектры флуоресценции. Существуют модификации lT, Xl.

Многоканальная съемка. Для препарата, меченного несколькими спектрально-различающимися красителями съемка производится последовательно для каждого красителя. После этого каждому из каналов присваивается определенный цвет, каналы складываются в одно цветное изображение. Здесь важно понимать, что детектор не различает цвета. Каждое изображение представлено в компьютере в градациях серого цвета. Цвета конечному изображению присваиваются либо вручную, либо автоматически с учетом соответствующего фильтра эмиссии.