Анализ изображения

После настройки контраста, яркости и шума, следующей ступенью процесса является идентификация объектов на изображении, оценка и классификация характерных признаков. Большинство объектов может быть охарактеризовано площадью (ядро, клетка), границей, длиной. Для идентификации объекта его нужно выделить и убрать фон. Часто полезно отнормировать шкалу серового в бинарный формат (все величины пикселей установить от 0 до 1). Установление порога (Thresholding). Применяется для отбрасывания информации об интенсивности пикселей с крайними значениями. Часто используется с последующим переводом изображения в битовый формат. Применение такого фильтра удобно для коррекции фона изображения и для подготовки изображения к морфологическому анализу. Существует множество фильтров, позволяющих осуществить морфологический анализ изображения. Среди них фильтры для выделения краев изображения, алгоритм эрозия-дилатация, фильтры выделения и классификации объектов по форме и т.д. На них подробно останавливаться не будем.

Рис.36.Установление порога и создание области выделения. А – исходное изображение в формате 8 бит; Б – установлен порог и выполнено преобразование в битовый формат, при этом все пиксели со значением меньше 80 стали черными, остальные – белыми; В – красный – контур области выделения (ROI).

При работе с живыми клетками часто приходится иметь дело с параметрами, изменяющимися во времени. При этом в эксперименте осуществляется захват временных серий изображений клеток, меченных флуоресцентными зондами, способными изменять интенсивность флуоресценции при изменении значений физиологических переменных. Так при исследовании динамики внутриклеточного кальция измеряют изменение интенсивности флуоресценции клеток, нагруженных кальциевым зондом (например, Fluo-4). Изменения флуоресценции при этом отражают изменение уровня кальция в клетках.

При обработке подобных серий изображений используют области выделения (ROI – region of interest) (рис.36В). Область выделения представляет собой набор смежных пикселей на изображении, заключенных в определенный периметр. Этот периметр определяется либо вручную, либо с помощью фильтров. На одном изображении можно создать несколько областей выделения. Анализ динамики флуоресценции проводится следующим образом: программа рассчитывает среднее значение (реже сумму) интенсивности пикселей в каждой области выделения отдельно для каждого кадра из серии. После этого строится график, на котором по горизонтальной оси – время измерения (в кадрах или секундах), а по вертикальной – средняя интенсивность флуоресценции в данной области выделения. Полученные графики затем можно отнормировать на максимальное значение (рис.37).

Рис.37. Одновременная регистрация изменения уровня цитозольного кальция (зеленый) по флуоресценции зонда Fluo-4 и митохондриального потенциала (красный) по флуоресценции ТMRM в клетках карциномы HEp-2 при последовательных добавках физиологически-активных веществ. Изображения клетки соответствуют указанному стрелкой моменту времени.

Современное развитие компьютерной техники и совершенствование микроскопов привели к созданию систем анализа изображения. В руках исследователей оказался мощный инструмент для прижизненных исследований тонкой структуры биологических объектов и быстрых клеточных процессов. Одним из направлений таких исследований является изучение поведения и регуляции уровня ионов кальция в клетках. Далее речь пойдет о современных методах определения динамики кальция в клетках и клеточных компартментах – митохондриях и саркоэндоплазматическом ретикулуме – с использованием флуоресцентной и конфокальной микроскопии.