Возбуждаемые ультрафиолетовым светом

Quin-2 (нератиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Quin-2 относится к первому поколению флуоресцентных Са²⁺-индикаторов. Квантовый выход и интенсивность флуоресценции низкие, поэтому требуются высокие концентрации красителя в клетках, что может приводить к «забуфериванию» зондом внутриклеточного Са²⁺, искажая цитозольный кальциевый сигнал.

Fura-2 (ратиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Рис.38. Спектры возбуждения и эмиссии Fura-2. А – Са2+-связанная форма; B – Ca2+-свободная форма.

Используя для окраски клеток низкие концентрации зонда (до 5мкМ) можно количественно измерять уровень [Са²⁺]_i. При образовании комплекса с ионами Са²⁺ наблюдается смещение спектра возбуждения Fura-2 с 363нм на 335нм. При этом спектр эмиссии с максимумом в районе 510нм не изменяется (рис.38). Для измерения отношения (ратиометрия) предпочтительнее возбуждать флуоресценцию Fura-2 на 340 и 380нм, так как максимум возбуждения бескальциевой формы красителя довольно близок к его изобестической точке (длине волны, при которой интенсивность флуоресценции не зависит от концентрации кальция).

Fura-2 удобен для использования в традиционной флуоресцентной микроскопии, он не подходит для измерений Са²⁺ с помощью конфокального микроскопа или проточной цитометрии, поскольку требует быстрой смены возбуждающих фильтров и нестандартных для конфокальной микроскопии лазеров.

Краситель имеет высокую чувствительность к Са²⁺, а значения K_d близки к базальному уровню Са²⁺ в покоящихся клетках млекопитающих. Однако чувствительность к Са²⁺ заметно уменьшается в присутствии физиологических концентраций Mg²⁺; K_d для Са²⁺ в безмагниевом буфере 135нМ, а в присутствии 1мМ Mg²⁺ - 224нМ. Fura-2 имеет высокое сродство и к другим двухвалентным катионам. Кроме того, у красителя сильно выражены компартментализация и связывание с белками, что еще больше снижает чувствительность Са²⁺. Однако эти свойства в некоторых случаях дают возможность использовать краситель для регистрации [Са²⁺] во внутриклеточных компартментах.

Натриевые и калиевые соли Fura-2 – не проходят через мембрану и загружаются в клетку с помощью микроинъекции, кроме того, эти соли используются для калибровки в системах in vitro. АМ эфиры легко проникают в клетку пассивной диффузией. На основе Fura-2 синтезирован зонд Bis-Fura-2, который содержит две флуоресцирующие группировки Fura-2 и один центр связывания кальция. При этом Bis-Fura-2 обладает более низким сродством к Са²⁺ и повышенным уровнем флуоресценции, что позволяет использовать более низкие концентрации красителя, уменьшая его влияние как буфера внутриклеточного Са²⁺. Bis-Fura-2 лучше, чем Fura-2 удерживается внутри клеток. Однако Bis-Fura-2 производится только в мембранно-непроницаемой форме, что ограничивает его применение.

Indo-1 (ратиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Indo-1, как и Fura-2, один из основных ратиометрических Са²⁺-индикаторов. Он используется в проточной цитофлуорометрии, где удобно применять одиночный лазер на возбуждении (спектральные линии аргонового лазера 351-364нм), а регистрировать эмиссию в двух длинах волн. При связывании с кальцием происходит смещение спектра эмиссии, что позволяет регистрировать сигнал свободной и связанной с кальцием форм красителя на разных длинах волн при одинаковом возбуждении. Максимум возбуждения красителя – 330-350нм, а максимум эмиссии сдвигается с 475нм в бескальциевой среде на 400нм, когда краситель насыщается Са²⁺ (рис.39). На практике для ратиометрии используют длины волн регистрации 405 и 485нм. Изобестическая точка находится в районе 450нм.

Рис.39. Спектры возбуждения и эмиссии Indo-1. А – Са2+-связанный; B – Ca2+-свободный.

Главный недостаток Indo-1 – его малая устойчивость к фотодеструкции. Однако, фотодеструкция мало влияет на отношение сигналов при ратиометрии, если использовать низкие интенсивности возбуждающего УФ. Тем не менее, быстрая фотодеструкция уменьшает отношение сигнал-шум и приводит к образованию Са²⁺-нечувствительных флуоресцирующих соединений, спектр флуоресценции которых близок к спектру свободного от кальция Indo-1. Автофлуоресценция NADH частично перекрывается со спектром бескальциевой формы Indo-1, что может искажать результаты измерений.

Indo-1 имеет высокое сродство к кальцию. Значение K_d (230нм) близко к обычным базальным уровням Са²⁺ в клетках. Зонд имеет высокую специфичность к кальцию. Однако, физиологические уровни ионов Mg²⁺ заметно изменяют связывание Са²⁺ красителем. Также Indo-1 проявляет довольно высокое сродство к другим двухвалентным катионам: Zn²⁺, Mn²⁺.

Калиевая соль Indo-1 – непроницаема для мембраны и вводится в клетку методом микроинъекции. Также она используется в качестве стандарта при калибровочных измерениях Са²⁺. АМ эфиры Indo-1 пассивно диффундируют через клеточную мембранную, что позволяет значительно упростить процесс загрузки зонда в клетки.

Синтезированы производные индикаторов Fura-2 и Indo-1, которые имеют низкое сродство к Са²⁺, позволяющие оценивать более высокие концентрации кальция при низких конценрациях зонда (Fura-4F, Fura-5F, Fura-6F, Indo-5F). Для измерения высокоамплитудных изменений уровня кальция в цитозоле и измерений кальция во внутриклеточных компартментах используются еще более низкоаффинные производные (Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-Indo-1).

BTC (ратиометрический, с низким сродством к Са²⁺)

BTC – Са²⁺-индикатор, основанный на кумарин-бензотиазоле. При связывании Са²⁺ у красителя происходит смещение максимума возбуждения с 464нм на 400нм, что позволяет проводить ратиометрические измерения. Его высокая чувствительность и низкое сродство к Са²⁺ (K_d ~7мкМ) позволяют более точно определять высокие уровни [Са²⁺] в гладких мышцах, нейронах и анализировать более быстрые изменения кальция, по сравнению с Fura-2, Indo-1. Протокол прокраски клеток похож на протокол для Indo-1 и Fura-2, с некоторыми особенностями: в раствор часто добавляют Probenecid (1-2, 5мM) или Sulfinpyrazone (0, 1-0, 25мM) для уменьшение утечки красителя.

Ратиометрические зонды очень удобно использовать для количественной оценки [Ca²⁺]_i, так как наличие смещения спектра при связывании с кальцием дает возможность измерять отношения интенсивности флуоресценции на разных длинах волн возбуждения для Fura-2 или эмиссии для Indo-1.