Mag-fura-2, Mag-indo-1, Mag-fluo-4

Рис.45. Кардиомиоцит крысы. Визуализация Са2+-запасающих компартментов саркоплазматического ретикулума с помощью Mag-Fluo-4. Флуоресценция зонда уменьшается при действии тапсигаргина.

Для измерения [Ca²⁺] в ретикулуме (ЭР) часто используются флуоресцентные Mg²⁺-индикаторы, связывающие ионы Cа²⁺с низким сродством: Mag-fura-2, Mag-indo-1 и Mag-fluo-4. Спектральные характеристики этих зондов практически совпадают с Fura-2, Indo-1, Fluo-4, соответственно, а константы диссоциации для Са²⁺ лежат в диапазоне от 22 до 35мкМ. Полагая, что концентрация ионов магния в клетках остается постоянной, изменения флуоресценции этих красителей отражают изменения концентрации кальция (рис.45).

Хлортетрациклин (CTC)

Рис.46.Культураклеткок карциномы HEp-2 окрашена CTC.

СТС – мембранно-проницаемый флуоресцентный зонд. СТС способен образовывать хелаты с двухвалентными катионами, причем комплекс обладает более гидрофобными свойствами, что способствует его проникновению во внутриклеточные мембранные структуры, где интенсивность его флуоресценции в гидрофобном окружении увеличивается в несколько раз. Флуоресценция измеряется в области 520-530нм, при возбуждении на 380нм (для ртутной лампы используют линию 405нм).

Для прокраски ЭР клетки инкубируют 40 минут с 12-20мкМ СТС при 37^оС, затем помещают в камеру флуоресцентного микроскопа и регистрируют изменения флуоресценции под действием Са²⁺-мобилизующих соединений. При этом изменение флуоресценции СТС отслеживает изменения Са²⁺, содержащегося в эндоплазматическом ретикулуме (рис.46).

Недостатком СТС является наличие большой фоновой флуоресценции, обусловленной комплексом СТС-Mg²⁺. Флуоресценция свободного от кальция СТС слабо зависит от рН в физиологическом диапазоне. Однако, зависимость флуоресценции комплекса СТС с Ме²⁺ достаточно сильная, т.к. рН влияет на диссоциацию комплекса СТС-Ме²⁺ – процесс, который сопровождается изменением квантового выхода флуоресценции СТС. Следует учесть, что СТС довольно быстро диффундирует через мембраны, что приводит к утечке зонда из клеток, поэтому СТС обычно используется в кратковременных экспериментах, либо клетки не отмывают от СТС, и он всегда присутствует во внешней среде.