Возбуждаемые видимым светом

Са²⁺-индикаторы, возбуждаемые светом в видимом диапазоне длин волн, имеют некоторые преимущества по сравнению с зондами, возбуждаемыми УФ: 1) спектры флуоресценция таких зондов не перекрываются со спектрами аутофлуоресценции; 2) зонды имеют высокий уровень интенсивности флуоресценции при связывании с кальцием; 3) степень цитотоксичности меньше, так как используются малые концентрации красителя; 4) возбуждение видимым светом дает возможность одновременного использования чувствительных к УФ caged-соединений; 5) с увеличением длины волны возбуждения уменьшается степень повреждающего действия интенсивного света на клетки. Перечислим основные кальциевые зонды, возбуждаемые светом видимого диапазона длин волн.

Fluo-3 (нератиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Рис.40. Спектры возбуждения и эмиссии связанного Са2+ Fluo-3.

Рис.41.Культура клеток HEp-2 нагружена Fluo-3 и потенциал-чувствительным зондом TMRM.

Fluo-3 – один из самых удобных Са²⁺-индикаторов для конфокальной микроскопии. Он был синтезирован из ВАРТА и флуоресцеин-подобной структуры. Fluo-3 слабо флуоресцирует в бескальциевой среде, при этом интенсивность флуоресцении при насыщении кальцием увеличивается более чем в 100 раз, а квантовый выход равен 0, 14. Максимумы возбуждения и эмиссии красителя 506 и 526нм, соответственно (рис.40). Fluo-3 эффективно возбуждается линией 488нм аргонового лазера. Значение K_d, близкое к 400нМ при физиололгических рН дает возможность использовать Fluo-3 для решения большинства задач исследования динамики цитозольного кальция в физиологическом диапазоне. Пожалуй, единственным недостатком Fluo-3 является невозможность ратиометрических измерений. Однако при совместной загрузке клеток Fluo-3 и Fura Red и возбуждении их в 488нм (конфокальная микроскопия) можно количественно оценить [Са²⁺] ратиометрическим методом. Fluo-3 также находит широкое применение при многоканальной съемке, например, для регистрации уровня цитозольного кальция и митохондриального потенцила (рис.41). Fluo-3 существует как в форме АМ эфира, так и в формах мембранно-непроницаемых калиевых и аммониевых солей.

Fluo-4 (нератиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Fluo-4 – аналог Fluo-3 с двумя замещёнными атомами хлора на атомы фтора, имеет K_d для Са²⁺ 345нМ. Квантовый выход флуоресценции примерно такой же как и у Fluo-3. Максимум возбуждения индикатора на 10нм смещён в синюю область по сравнению с Fluo-3, в результате чего значительно увеличивается эффективность возбуждения 488нм лазером. Существуют как формы АМ эфиров и калиевых солей, так и декстраны.

Rhod-2 (нератиометрический, с низким сродством к Са²⁺)

Рис.42. Спектры возбуждения и эмиссии связанного c Са2+ Rhod-2.

Rhod-2 – длинноволновый Са²⁺ индикатор – производное родамина, который применяется для экспериментов на клетках и тканях, имеющих высокие уровни аутофлуоресценции, а также для измерения динамики Са²⁺ в фоторецепторах и при использовании фотоактивируемых УФ комплексов (caged-соединений). Флуоресценция зонда увеличивается в три-четыре раза при связывании с Са²⁺. Максимум возбуждения Rhod-2 – 552нм, эмиссии – 581нм (рис.42). Молекула Rhod-2 несет положительный заряд, что позволяет использовать этот зонд для регистрации уровня митохондриального кальция. При этом накопление красителя в митохондриях определяется протоколом загрузки. Спектры эмиссии Rhod-2 и Fluo-4 не перекрываются, поэтому такую комбинацию удобно использовать для одновременной регистрации уровня митохондриального и цитозольного кальция. Rhod-2 также часто используют для измерений [Са²⁺] в клетках мозга in situ.

Синтезированы также производные Rhod-2, отличающиеся от него спектрально и по сродству к кальцию. Например, X-Rhod-1 обладает максимумом возбуждения 580нм, эмиссии 602нм и K_d ~700нМ. Rhod-2 и его производные выпускаются в виде эфиров и калиевых солей.

На основе Fluo-3 и Rhod-2 также синтезированы производные, которые имеют низкое сродство к Са²⁺ (Fluo-5F, Fluo-4FF, Fluo-5N, Mag-Fluo-4; Rhod-5N, Rhod-FF, X-Rhod-5F, X-Rhod-FF). Такие зонды могут использоваться для регистрации высокоамплитудных изменений уровня внутриклеточного Са²⁺.

Calcium Green (нератиометрический)

Спектр возбуждения и эмиссии Calcium Green очень схож со спектром Fluo-3, но при высоких концентрациях Са²⁺ флуоресценция Calcium Green в несколько раз выше (квантовый выход насыщенного кальцием Calcium Green ~0, 75), к тому же этот индикатор менее фототоксичен. Calcium Green по степени сродства к Са²⁺ разделяется на: Calcium Green-1 и Calcium Green-2 имеющие низкие K_d; Calcium Green-5N с меньшим сродством к Са²⁺. Calcium Green применяют для ратиометрических измерений при совместной загрузке с Fura Red.

Calcium Orange, Calcium Crimson (нератиометрические)

Calcium Orange, Calcium Crimson – длинноволновые индикаторы, основанные на Tetramethylrhodamine и Texas Red, соответственно. Максимум возбуждения Calcium Orange 549нм, а эмиссии – 576нм. Его можно использовать, например, для регистрации Са²⁺ в интактных фоторецепторах. Максимумы возбуждения и эмиссии у Calcium Crimson в 590 и 615нм, соответственно. Этот индикатор удобен, так как его эмиссия не перекрывается с автофлуоресценцией. Благодаря своим спектральным характеристикам, эти зонды применяются для загрузки совместно с синими или зелеными флуоресцентными красителями.

Oregon Green BAPTA (нератиометрический)

Oregon Green – это длинноволновый индикатор, его спектр похож на спектр флуоресцеина (например Calcium Green). Однако, из-за смещенного максимума возбуждения в синюю область (492нм), индикатор более эффективно возбуждается в 488нм аргоновым лазером. Oregon Green проявляет большую фотостабильность и меньшую рН-зависимость при физиологических значениях рН, чем производные флуоресцеина.

Fura Red (ратиометрический, с высоким сродством к Са²⁺)

Рис. 43. Спектры возбуждения и эмиссии для Fura Red и Fluo-4. Возбуждение – 488нм.

Fura Red – это индикатор, возбуждаемый видимым светом, структурно схожий с Fura-2. Применяется при ратиометрических измерениях кальция в клетках (возбуждение 420 и 480нм, максимум эмиссии 660нм). При возбуждении линией 488нм аргонового лазера при связывании Са²⁺
флуоресценция Fura Red уменьшается. Используя это свойство, проводят ратиометрические измерения при одновременной прокраске Fura Red и Fluo-4 (рис.43). Квантовый выход Fura Red значительно меньше, чем у Fluo-4, а значение K_d ~140нм при физиологических уровнях pH. Поэтому при единовременной загрузке с Fluo-4 нужно использовать большие концентрации Fura Red, что может приводить к забуфериванию внутриклеточного кальция красителями.