Калибровка

Калибровкавыполняется для количественного определения [Ca²⁺], основываясь на степени интенсивности флуоресценции кальций-связанных и свободных форм красителей. K_d для Са²⁺-индикаторов очень чувствительна к ряду факторов внутриклеточной среды: температуре, рН, ионной силе, вязкости, взаимодействию индикатора с белками. Следовательно, значения K_d, определённые in vivo могут не соответствовать значениям, полученным in vitro, поэтому необходимо иметь калибровки для каждого из исследуемых объектов.

Обычно используются два вида калибровки: in vitro и in vivo. Калибровка in vitro проводится с использованием Са²⁺-EGTA буферов, содержащих не эстерифицированную форму индикатора. При этом концентрация свободного кальция определяется отношением концентраций [EGTA]/[Ca²⁺] при прочих постоянных условиях (температура, pH, содержание других катионов).

Калибровка in vivo проводится в экспериментальных условиях на окрашенных клетках, поскольку свойства красителя в цитозоле могут отличаться от свойств в растворе in vitro. Калибровку получают, используя Ca²⁺-EGTA-буфер, содержащий невысокие концентрации кальциевого ионофора (иономицин, А-23187, 4-бром-А-23187). Однако следует отметить, что для некоторых типов клеток, таких как кардиомиоциты, воздействие ионофором приводит к изменению формы и объёма клетки. В этом случае для получения максимального кальциевого сигнала в цитозоле можно применить метод истощения запаса энергетических субстратов – АТФ и глюкозы или добавление разобщителя СССР (carbonyl cyanide m -chlorophenylhydrazone) и ротенона для деэнергизации клеток. Для некоторых типов клеток используют низкие концентрации Digitonin или Triton X-100.

Для ратиометрических измерений концентрация ионов кальция соотносится с измеренной интенсивностью флуоресценции как

[Ca²⁺] = β × K_d × (R - R_min) / (R_max – R),

где R – эксперементально измеренное отношение интенсивностей флуоресценции при двух длинах волн;

R = (f₁ – f_1фон) / (f­₂ – f_2фон),

где f₁ – значение интенсивности флуоресценции при 340нм для Fura-2 и 405нм для Indo-1 (кальций-связанной формы зонда);

f₂ – значение интенсивности флуоресценции при 380 для Fura-2 или 485нм для Indo-1(кальций-свободная форма зонда);

R_min – измеренное отношение интенсивностей флуоресценции при минимальной концентрации Ca²⁺ (R_min = f₁ / f₂);

R_max – отношение интенсивностей флуоресценции при максимальной концентрации кальция (R_max = f₁ / f₂);

β – отношение интенсивностей флуоресценции кальций-свободной формы красителя при минимальной и максимальной концентрации кальция (β = f_2min/f_2max);

K_d – коснтанта диссоциации Ca²⁺-индикатора.

R_max и R_min получают во время калибровки in vivo.

В экспериментах на кардиомиоцитах клетки помещают в бескальциевую среду с 5мкМ СССР и 2мкМ Rotenone на 10-20 минут. После этого заменяют среду на содержащую 2мМ CaCl₂ и нефлуоресцентный ионофор, например 10мкМ бром-А23187, также в присутствии Rotenone и СССР. После достижения максимума кальция в цитозоле (примерно через 10 минут) можно зафиксировать значение R_max. Далее среда заменяется на бескальциевый раствор с 10мМ EGTA в присутствии ротенона и СССР без ионофора или с ним. Через 10 минут можно измерять R_min. Лучше всего брать среднее значение R_min и R_max из 3-5 повторов.

K_d можно получить из калибровки in vitro, используя форму индикатора в виде калиевой соли. Для большинства случаев подходят табличные значения константы диссоциации.

β – это отношение уровней абсолютной флуоресценции, и, следовательно, требует постоянного количества красителя. Флуоресценция должна быть измерена как в растворе с высоким содержание кальция, так и безкальциевом растворе с EGTA. Это может быть достигнуто при калибровке in vivo. Для Fura-2 β =1, если в качестве второй используется близкая к изобестической точке длина волны 360 нм. Это упрощает калибровку, однако уменьшает отношение при увеличении [Ca²⁺]_i. В случае использования отношения 340/380 для Fura-2 β будет больше 1, и отношение будет увеличиваться при росте[Ca²⁺]_i.

Флуоресцентные кальциевые зонды,