Измерение динамики кальция в митохондриях

Rhod-2. АМ эфиры кальциевых индикаторов-производных родамина (Rhod-2, Rhod-5N, Rhod-FF, X-rhod-1, X-rhod-5F, X-rhod-FF) несут положительный заряд. Таким образом, механизмом накопления этих зондов в митохондриях является электростатическое взаимодействие с мембраной митохондрий. Преимущественной локализации красителя в митохондриях (рис.44) добиваются, используя специальные температурные и временные условия загрузки АМ эфира в клетки.

Рис. 44.Культуранейронов и астроцитов гипокампа крысы. Красный – Rhod-2 – [Ca2+]m; Зеленый – Fluo-4 – [Ca2+]i.

Классический протокол загрузки похож на протокол для Fluo-4 только после отмывки буфером следует инкубировать клетки в течении 12-24 часов. За это время немитохондриальная фракция красителя удаляется из цитозоля. В качестве специального протокола Донной Троллингер и коллегами был предложен двухстадийный протокол: холодная загрузка/теплая отмывка. Кардиомиоциты инкубировась с 5мкМ Rhod-2AM в течении 30 минут при 4°С (буфер, в котором растворяется индикатор, содержал 10% сыворотки). После этапа холодной загрузки клетки инкубируются в течении 4-6 часов при 37°С в среде без сыворотки. Непосредственно перед экспериментом кардиомиоциты дважды отмываются средой. Низкая температура на первом этапе загрузки нужна для снижения активности внутриклеточных эстераз. При этом зонд в мембранно-проницаемой АМ форме проникает в митохондрию. Дженет Тальбот и коллеги загружали клетки 50мкМ Rhod-2 AM в течении 2 минут, далее отмывали 5-10 раз буфером, не содержащим красителя, в течении 1 часа.

Дигидро-rhod-2. Восстанавливая Rhod-2AM NaBH₄ до бесцветного, нефлуоресцентного дигидро-rhod-2AM, можно добиться дополнительного уменьшения флуоресцирующей формы зонда в цитозоле клеток. При попадании дигидро-rhod-2 в матрикс митохондрий довольно быстро происходит его окисление до Rhod-2. При этом флуоресцирующая форма зонда оказывается локализованной только в митохондриях.

Протокол: к растворенному в DMSO Rhod-2AM добавляют небольшой избыток NaBH₄ (сухого или растворённого в метаноле) и перемешивают до обесцвечивания. Далее разводят полученный раствор рабочим буфером и загружают в клетки как в классическом протоколе для Rhod-2.

Для контроля локализации Rhod-2 в митохондриях используется одновременная загрузка клеток этим зондом и зондом, специфически накапливающимся в митохондриях, но отличающимся от Rhod-2 по спектру флуоресценции. Например, потенциал-чувствительный Rhodamine-123 или маркер митохондрий MitoTracker Green. По степени колокализации этих зондов определяют избирательное накопление Rhod-2 в митохондриях.