Флуоресцентные зонды

Флуоресцентные кальциевые красители могут представлять собой либо синтетические низкомолекулярные производные кальциевых хелаторов (например, BAPTA), либо иметь полипептидную природу (биолюминесцентные белки – экворин, обелин).

Синтетические кальциевые зонды наиболее часто используются в качестве Са²⁺-индикаторов ввиду простоты их введения в клетку и высокого квантового выхода. Такие соединения способны изменять квантовый выход или характерные спектры возбуждения или флуоресценции при связывании с Са²⁺.

Са²⁺-красители производятся в различных химических формах, таких как соли, эфиры, конъюгаты с декстраном. Химическая форма зонда определяет методы введения индикатора в клетку, распределение зонда по внутриклеточным компартментам, степень токсичности и способность красителя оставаться в цитоплазме в течение длительного времени. Красители в виде солей и конъюгатов с декстраном обычно вводятся в клетку с помощью микроинъекции или введения из пэтч-клямп пипетки. Наиболее удобно использовать мембранно-проницаемые ацетоксиметильные (АМ) эфиры кальциевых зондов. В такой форме краситель может пассивно проникать в клетки за счет гидрофобного AM-хвоста. Попадая внутрь клетки АМ-форма зонда подвергается деэстерификации внутриклеточными эстеразами. При этом образуется заряженная форма, которая не может диффундировать через плазмалемму. Таким образом, индикатор остается в цитоплазме длительное время.

Одной из основных характеристик Са²⁺-индикаторов является их сродство к Са²⁺, которое отражает константа диссоциации (K_d). Зависимость интенсивности флуоресценции зонда от концентрации кальция носит линейный характер в диапазоне от 0, 1× K_d до 10× K_d. Са²⁺-зонды с высоким сродством (низкая K_d) могут являться буферами внутриклеточного Са²⁺ и искажать кальциевые сигналы клеток. Для измерения [Са²⁺] во внутриклеточных кальций-запасающих компартментах, где концентрации кальция могут достигать 1мМ, синтезированы красители с низким сродством к Са²⁺ (Mag-Indo-1, Mag-fura-5, Mag-fluo-4). При этом зонд малочувствителен к физиологическим изменениям кальция в цитозоле (100нм – 2мкМ). Значение K_d кальциевых индикаторов существенно зависит от многих факторов, включающих рН, температуру, ионную силу и вязкость раствора, связывание зондов c белками, присутствие Mg²⁺ и других ионов. Как правило, значения K_d индикаторов в клетках несколько выше, чем значения K_d, измеренные in vitro в бесклеточных растворах.