Измерение динамики кальция в цитозоле

Существуют две основные группы флуоресцентных зондов, используемых для измерения концентрации свободного кальция в цитозоле – возбуждаемые ультрафиолетовым (менее 400нм) и видимым светом (400-700нм). При облучении живых клеток ультрафиолетом (УФ) наблюдается сильный фототоксический эффект, что проявляется в дестабилизации кальциевого гомеостаза клеток без дополнительных внешних воздействий, внося возможность ошибочной интерпретации полученных данных. Есть и другие причины, затрудняющие использование флуорофоров, возбуждаемых УФ: применение ультрафиолетового света в качестве источника возбуждения флуоресценции ограничены собственно оптикой микроскопов – с одной стороны, стекло плохо пропускает УФ, с другой – необходимо применять оптику, скорректированную на хроматические аберрации. Тем не менее, возбуждаемые УФ кальциевые индикаторы до сих пор широко используются, так как позволяют проводить ратиометрические измерения. При связывании ратиометрического зонда с кальцием наблюдается заметный сдвиг спектра возбуждения (Fura-2) или спектра флуоресценции (Indo-1). Это дает возможность одновременно оценивать интенсивность флуоресценции кальций-связанной и кальций-свободной форм красителя при различных длинах волн возбуждения или регистрации. При этом отношение интенсивностей флуоресценции в этих длинах волн существенно не зависит от концентрации красителя в клетке, эффектов, связанных с фотодеструкцией красителя, и аутофлуоресценией образца. При нератиометрических измерениях [Ca²⁺]_i интенсивность флуоресценции зависит от концентрации индикатора (флуоресцирующего вещества) в клетке. Эта зависимость носит нелинейный характер. Проиллюстрировать это позволяет следующая задача:

Вопрос: Правильное ли утверждение, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества?

Рассуждение: а) Допустим, что из 100 падающих квантов флуоресцирующее вещество поглощает 50. Интенсивность флуоресценции будет 50 неких единиц.

б) При удвоении концентрации вещества, интенсивность флуоресценции тоже удвоится и будет 100 тех же единиц. Это происходит за счет того, что вдвое увеличится количество поглощенных квантов (при шаге а) поглощалась половина квантов, поэтому при шаге б) будут поглощены все 100 квантов).

в) Ещё одно удвоение концентрации - интенсивность флуоресценции останется та же – 100 единиц. Поскольку все кванты поглощались уже на стадии б), интенсивность флуоресценции не изменится.

Это означает, что предположение о том, что интенсивность флуоресценции всегда пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества неверно.

Ответ: Интенсивность флуоресценции пропорциональна величине (1-Т), где Т – пропускание объекта при соответствующей длине волны излучения, возбуждающего флуоресценцию.

Т=10^–D, где D=ε Cd, где С – это концентрация флуоресцирующего вещества.

Разложим (1-Т) в ряд и увидим, что при D< 0, 1, величина (1-Т) прямо пропорциональна с точностью до процентов концентрации С. Итак, при малом поглощении (D< 0, 1) интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества.

Флуоресцентные кальциевые зонды,