Процедуры загрузки индикатора

Загрузка эфира. Большая часть флуоресцентных кальциевых индикаторов в форме солей или свободных кислот плохо проникают в клетку. Поэтому многие из них синтезируются в форме ацетоксиметильных (АМ) эфиров, которые могут довольно легко диффундировать через мембрану. В клетке АМ-группа подвергается отщеплению посредством внутриклеточных ферментов – эстераз. Такая деэстерифицированная форма зонда теряет способность диффундировать через мембраны и остается в клетке.

Конечная концентрация гидролизованного Са²⁺-индикатора внутри клетки зависит от ряда факторов (типа и количества клеток, химических свойств красителя, времени и температуры загрузки, предварительные условия и др.) Конечная концентрация зонда в клетке может быть в несколько сот раз больше исходной концентрации эфира в растворе.

Обычно исходный сухой индикатор растворяют в безводном диметилсульфоксиде (DMSO) до концентрации 1-10мМ. Полученный раствор после продувки аргоном может храниться при –20°С. Перед загрузкой раствор разбавляют в клеточном буфере без сыворотки до конечной концентрации 1-10мкМ, с конечной концентрацией DMSO ≤ 0, 1%. АМ эфиры слаборастворимы в воде, поэтому в этой процедуре используются диспергирующие агенты, способствующие окрашиванию клеток. Pluronic F-127 – неионный диспергирующий агент, который помогает растворять большие молекулы красителя в физиологическом растворе. Клетки инкубируются с индикатором при температуре 20-37°С в течении 15-60 минут, для большинства красителей 40мин. После этого дважды отмываются буфером без красителя и инкубируются без красителя 10-20 минут для окончательной деэстерификации и отмывки оставшегося примембранного зонда снаружи клетки. При длительной загрузке, в раствор следует добавлять 1мг/мл BSA или 1–5% сыворотки для поддержания онкотического давления. Однако сыворотка может содержать неспецифические эстеразы, которые гидролизуют АМ эфир еще до проникновения в клетку.

Методом загрузки АМ эфира можно прокрашивать клеточные культуры и суспензии, а также целые органы. В то же время, с загрузкой АМ эфиров связаны некоторые проблемы, например, компартментализация и неполный гидролиз эфира.

Микроинъекция. Са²⁺-индикаторы в форме солей, являясь гидрофильными, не способны проникать в клетку посредством диффузии. А некоторые комплексы зондов с декстранами и полипептидные кальциевые индикаторы слишком громоздки, чтобы пересечь наружную мембрану клетки. Такие соединения вводятся непосредственно в цитоплазму клеток посредством микроинъекций. Для растворения кальциевого зонда при этом используют внутриклеточные буферы. Однако, этот метод – инвазивный и требует специального оборудования и навыков. Кроме того, количество клеток, которое может быть загружено таким способом, ограничено (лучшие микроинъекторы могут загружать только 100 клеток/ч). Реже используют метод диффузии из пэтч-кламп пипеток.

Диффузия через щелевые контакты. Эта методика применяется для прокраски ткани или органа. Во время ферментативной обработки, некоторые межклеточные щелевые контакты сохраняют проницаемость для внешних растворов, позволяя индикаторам диффундировать в цитозоль.

АТФ-индуцируемая пермеабилизация. Внеклеточный АТФ вызывает различные ответы во многих типах клеток. В гепатоцитах, тучных клетках, полиморфно-ядерных лейкоцитах и некоторых трансформированных клетках внеклеточный АТФ индуцирует поток катионов и увеличивает проницаемость плазматической мембраны через АТФ^4--рецептор для соединений с молекулярным весом < 900Да. Этот феномен используется для нагрузки клеток различными зондами, причем вход зонда можно прекратить добавлением ионов магния. Ограничение применения этого метода – не все типы клеток способны к АТФ-индуцируемой пермеабилизации.

Обработка гипоосмотическим шоком используется для загрузки экворином различных типов клеток. Клетки отмываются несколько раз холодным бескальциевым раствором. Затем клетки перемещают в гипоосмотический раствор с индикатором на 2-5 минут. При этом наблюдается резкое увеличение проницаемости плазмалеммы. Эффективность прокраски этим методом весьма высока, но многие клетки погибают, не выдерживая стрессорного воздействия.

Гравитационная загрузка используется для нагрузки клеток экворином при работе с клеточными суспензиями. Клетки трижды отмываются в холодном растворе без Са²⁺ центрифугированием (50g в течение 2 минут). Затем клетки инкубируют с красителем 10 минут при 4°С, и центрифугируются (200g 30 секунд). Точный механизм проникновения красителя неизвестен. Возможно, проявляется неспецифическая проницаемость плазмалеммы во время центрифугирования.

Скраб-загрузка. Этот способ загрузки крупных молекул применяется для культур клеток. Клетки, культивируемые на чашках, соскабливаются в буфер с красителем. Затем клетки несколько раз отмываются, вновь помещаются на чашки и культивируются. Соскабливание повреждает плазматическую мембрану в местах прикрепления клетки, обеспечивая временную проницаемость для макромолекул. Один из недостатков сраб-загрузки – невозможность его применения для изолированных клеток, которые не прикрепляются к чашке с образованием монослоя.

Метод загрузки с помощью липосом. Индикатор доставляется в клетки при слиянии с катионными липосомами, содержащими краситель. Эффективность метода определяется типом катионного реагента, типом клетки, культуральными условиями.