Флуоресцентные фильтры

Отрезающие светофильтры разделяют поток излучения на проходящий и отраженный потоки различного спектрального состава. Различают два вида отрезающих светофильтров: длинноволновые отрезающие (shot pass filter или SP filter, также используется аббревиатура KP, где K – kurz (нем.)=short) и длинноволновые пропускающие (long pass filter или LP filter). SP фильтры задерживают более длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый (рис.21), а LP фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый (рис.22). Если использовать комбинацию из LP и SP фильтров, можно получить запирающий фильтр (BP band pass), который позволяется проходить свету определенного участка спектра, а остальные длины волн задерживаются (рис.23). В современных системах запирающие фильтры применяются при многоканальной регистрации флуоресценции, а LP наиболее эффективны в системах с цветными камерами в качестве детектора.

Рис.21.Длинноволновый отрезающий фильтр.	Рис.22.Длинноволновый пропускающий фильтр.	Рис.23.Запирающий фильтр.

Рис.24.Комбинация возбуждающего фильтра, светоделителя и фильтра эмиссии для регистрации флуоресценции FITC и схожих по спектральным характеристикам флуорофоров.

Как правило, фильтр возбуждения, светоделитель и фильтр эмиссии собраны вместе в блоки – «кубы» (см. рис.18). Спектральные характеристики светофильтров в кубе подобраны таким образом, чтобы обеспечить эффективную работу с набором флуорофоров, имеющих сходные спектры возбуждения и эмиссии. Так фильтр возбуждения должен выделять из спектра источника света тот участок, который наиболее эффективен для возбуждения данного флуоресцентного зонда. Светоделитель должен отражать возбуждающий свет, но пропускать свет флуоресценции красителя. Фильтр эмиссии должен пропускать свет, излученный флуорофором. На рисунке 24 представлены спектральные характеристики компонентов флуоресцентного куба.

При приобретении флуоресцентного микроскопа и системы анализа изображений необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светофильтров, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся зондов. При этом ситуация усложняется в случае многоканальной съемки, когда используются несколько флуоресцентных зондов. Такой подход находит применение при исследованиях колокализации внутриклеточных структур, а также при одновременной регистрации нескольких параметров. Здесь встает вопрос о правильном выборе флуоресцентных зондов. При этом спектры эмиссии разных зондов не должны пересекаться между собой. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных. Например, при одновременной регистрации уровня цитозольного кальция с помощью зонда Fluo-4 (максимум возбуждения 488нм, максимум флуоресценции 525нм) и регистрации митохондриального потенциала зондом TMRM (возбуждение 543нм, регистрация – более 560 нм) нельзя использовать LP фильтр эмиссии для регистрации флуоресценции Fluo-4, поскольку TMRM возбуждается светом 488 и на выходе будет регистрироваться сигнал с обоих зондов. Явление пересечения спектров эмиссии называется термином crosstalk. В таком случае лучше использовать запирающий фильтр 500-550 нм., который будет отсекать сигнал TMRM. При использовании большего количества зондов вообще не обойтись без запирающих фильтров. Тем не менее не всегда имеется возможность избавиться от перекрытия спектров эмиссии при многоканальной съемке. Существуют алгоритмы разделения каналов с помощью специального программного обеспечения.