Дифракционная теория микроскопа

Следует заметить, что в настоящее время микроскоп используется не только как прибор, позволяющий получить увеличенное изображение микрообъекта с целью изучения его морфологии, но и как прибор, позволяющий выделить информацию о микрообъекте из электромагнитного излучения (света), провзаимодействовавшего с объектом. Все параметры электромагнитного излучения, после взаимодействия с объектом могут изменяться: интенсивность, частота, степень и направление поляризации, фаза. В зависимости от того, изменение каких параметров или их комбинаций представлят интерес для исследователя, применяется соответствующий метод микроскопирования. Поэтому представление о работе микроскопа, основывающееся только на геометрической оптике, как правило, достаточно для рутинной работы, но недостаточно для использования его в исследовательских целях. Приведем пример из истории применения микроскопа, демонстрирующий это утверждение. Довольно долго систематики-альгологи различали среди похожих по форме диатомовых водорослей рода Nitzschia разные виды в зависимости от рисунка на поверхности. Эта водоросль представляет собой сильно вытянутый эллипсоид. У некоторых водорослей наблюдалась продольная штриховка поверхности, у других – поперечная, у третьих – сетчатая, а у четвертых – вообще отсутствовала. Оказалось, что все это деление по видам было просто недоразумением, т.к. видимый рисунок на поверхности зависел от настройки микроскопа, от качества конденсора и объектива. Для понимания этого необходимо представление о дифракционной теории микроскопа.

Одной из основных характеристик микроскопа является его разрешающая способность, или разрешающая сила. Вследствие особенностей, связанных с физической природой света любой точечный объект при увеличении с помощью микроскопа становится размытым, и изображение такой точки в результате дифракции перекрывается с изображением от соседнего объекта. Даже если искажения в оптической системе (аберрации) полностью скорректированы, изображения двух близких точек объекта могут оказаться неотличимы от изображения одной точки. Этот факт накладывает серьезные ограничения на разрешающую способность оптических систем.

Рис.8.Дифракционные пятна и их профили интенсивности. Слева – разрешенные точки. Справа – точки будут разрешены, если провал (а)между профилями интенсивности меньше 26% от максимума.

При дифракции на границе линзовых элементов микроскопа изображение точки состоит из центрального светлого пятна (диск Эйри), на которое приходится приблизительно 85 % энергии света, и окружающих его светлых и темных колец (рис.8). Это дифракционное пятно и принимается за изображение точечного источника. Таким образом, разрешение оптической системы микроскопа будет определяться степенью перекрытия дифракционных пятен соседних точек образца. Рэлеем был предложен критерий: изображения точек можно считать разрешенными, если провал между профилями интенсивности двух точек составляет 26% от максимума. В этом случае минимальное расстояние между точками, разрешенными с помощью микроскопа составит:

l _min=0, 61λ / n sinα,

где λ – длина волны света,

n – показатель преломления имерсионной среды,

α – так называемый аппертурный угол.

Аппертурный угол – это максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы. Величина NА= n sinα называется числовой аппертурой.

Как видно из формулы, разрешение зависит от длины волны света, формирующего изображение, и от числовой апертуры. Чем выше числовая апертура, тем лучше разрешение. При этом дополнительно повысить разрешение помогает увеличение коэффициента преломления среды. При использовании иммерсионных жидкостей с коэффициентами преломления близкими к коэффициенту преломления стекла, можно добиться максимального апертурного угла. Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива не превышает 1, 0, поэтому его разрешающая способность будет более 0, 3мкм для λ =500нм. Для иммерсионного — NА доходит до 1, 45 в зависимости от показателя преломления иммерсии и технологических возможностей изготовления фронтальной линзы (разрешающая способность такого объектива около 0, 2мкм).

Разрешение также зависит от длины волны света, причем при уменьшении длины волны (сдвиг в сторону фиолетовой области спектра), увеличивается разрешающая способность системы. Таким образом, существует некий дифракционный предел разрешения микроскопа, поскольку нельзя неограниченно уменьшать длину волны света и увеличивать числовую апертуру объектива. Существование этого предела было постулировано Эрнстом Аббе. Посчитано, что для зеленого света он составляет около 200нм. Эта величина считается предельным разрешением световой микроскопии.

В настоящее время технические возможности позволяют создать микроскопы общим увеличением до 6000х, но вследствие дифракционных ограничений такой микроскоп нецелесообразен. Существует эмпирическое правило – для достижения максимального разрешения в микроскопе общее увеличение должно находиться в диапазоне 500-1000 числовых апертур объектива. Таким образом, нет смысла создавать микроскопы с увеличением более 1, 4× 1000=1400 крат, если в качестве приемника изображения используется глаз.

В современных системах анализа изображения, в том числе конфокальной микроскопии, разрешение зависит не только от оптических возможностей системы. Это связано с тем, что в такой системе происходит дополнительное преобразование оптического сигнала в электрический (на элементах детекторов), цифровой (на аналого-цифровом преобразователе), снова оптический (при выводе изображения на экран монитора). На каждой из этих стадий преобразования разрешение всей системы может ухудшаться.

Перечислим основные моменты дифракционной теории Аббе и следствия из нее:

1. Каждый объект вызывает в промежуточной плоскости микроскопа характерное изображение источника света. Эта промежуточная плоскость, как правило, совпадает с задней фокальной плоскостью объектива. Аббе называл это первичным интерференционным изображением объекта. (Легко проделать такой опыт. В качестве объекта можно взять сетку с расстоянием между нитями около 1мкм, полностью закрыть апертурную диафрагму, вынуть из микроскопа окуляр и посмотреть на выходную линзу объектива. Мы увидим ряды изображений источника света.)

2. Изображение объекта, даваемое микроскопом, возникает как результат интерференции волн, выходящих из дифракционного изображения источника света.

3. Изображение объекта следует представлять как вторичное интерференционное изображение.

4. Вид вторичного интерференционного изображения полностью определяется характером первичного интерференционного изображения.

5. Если при каких-либо условиях выпадает часть первичного изображения, то вторичное изображение в зависимости от соотношения между выпавшей и действующей частями становится в большей или меньшей степени сходным с объектом. Другими словами, чем больше дифракционных максимумов передаст объектив для образования первичного интерференционного изображения, тем точнее вторичное изображение будет соответствовать самому объекту.

6. Для разрешающей способности объектива определяющей является его апертура.

7. Увеличение микроскопа определяется также апертурой объектива и не может быть больше, чем 1000NА. Т.е. не имеет смысла, например, с объективом 10х0, 2 применять окуляр 32х, чтобы получить увеличение микроскопа 320х, т.к. 1000× 0, 2=200 – это предельное увеличение для объектива с данной аппертурой.