Краткая история микроскопии

Учебно-методический центр

Пущинского научного центра

Учебный центр

Института биофизики клетки РАН

Бережнов А.В., Зинченко В.П., Федотова Е.И., Яшин В.А.

ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ В

ИССЛЕДОВАНИЯХ ДИНАМИКИ Са²⁺ В КЛЕТКАХ

Г. Пущино, 2007 г.

Оглавление

Краткая история микроскопии 2

Основы геометрической теории микроскопа 4

Обобщенная схема оптического микроскопа проходящего света 8

Дифракционная теория микроскопа 10

Аберрации 13

Устройство микроскопа 16

Классификация микроскопов 17

Объективы 18

Методы контрастирования 20

Флуоресценция 23

Флуоресцентный микроскоп 26

Источники света 27

Флуоресцентные фильтры 28

Детекторы 29

Конфокальный микроскоп 31

Цифровое изображение 35

Обработка и анализ изображения 38

Исследование динамики кальция в клетках флуоресцентными

методами 42

Флуоресцентные зонды 42

Измерение динамики кальция в цитозоле 43

Флуоресцентные кальциевые зонды, возбуждаемые ультрафиолетовым

светом 44

Калибровка 47

Флуоресцентные кальциевые зонды, возбуждаемые видимым светом 49

Калибровка 52

Измерение динамики кальция в клеточных компартментах 52

Измерение динамики кальция в митохондриях 52

Измерение динамики кальция в саркоэндоплазматическом

ретикулуме 54

Биолюминесцентные кальциевые индикаторы 55

Процедуры загрузки индикатора 57

Потенциальные проблемы, связанные с загрузкой зондов 59

Обработка полученных результатов 62

Заключение 64

Краткая история микроскопии

Микроскоп является незаменимым инструментом для биологов многих специальностей. Причина этого очевидна: клетки живых организмов имеют слишком малые размеры, чтобы можно было наблюдать их невооруженным глазом. Поэтому для исследований столь мелких объектов необходимо прибегать к помощи увеличительных приборов.

О возможности увидеть увеличенное изображение объектов люди знали еще с древних времен, когда заметили, что способностью увеличения обладают сферические капли воды. В ХI в. н.э. для чтения использовались стеклянные сферы (Reading stones), которые помогали увеличивать текст. В ХIII в. Роджер Бэкон использовал сегменты стеклянных шариков как увеличительные стекла и рекомендовал их людям с плохим зрением, а уже в 1284г. итальянец Сальвино Д`Армате сконструировал первые очки.

Рис.1. Микроскоп Левенгука. Состоит из единственной мощной линзы, смонтированной на пластине, держателя для образца и двух винтов для фокусировки.

В 1590г. два специалиста по производству очков Захариас Янсен и его сын Ганс из нидерландского города Миддельбурга экспериментировали с несколькими линзами, помещенными в трубку одна над другой. Они заметили, что объекты, находящиеся перед такой трубкой, становятся сильно увеличенными. По другим источникам изобретателем микроскопа был нидерландец Дреббель (1572-1634) из Алькмаара. По итальянским источникам микроскоп изобрел Галилео Галилей в 1610 году. Так или иначе, первые микроскопы появились в Нидерландах в конце ХVI – начале XVII века. Это были прототипы сложных микроскопов – состоящих из двух линз. Параллельно с открытием Янсенов шло усовершенствование технологии изготовления самих линз. В этом наиболее преуспел голландский торговец мануфактурой Антони Ван Левенгук (1632-1723), который разработал собственные методы шлифовки и полировки стекол. Он изготовил не менее 400 микроскопов, но все они загадочно исчезли. В настоящее время в университетском музее в Утрехте существует лишь один полностью сохранившийся микроскоп Левенгука (рис.1). Линзы Левенгука давали увеличение до 300 крат и были вершиной развития простых «однолинзовых» микроскопов (для сравнения, первые сложные микроскопы увеличивали в 20-30 раз). В письмах он утверждал, что «хранит для себя одного и свои самые лучшие микроскопы, и свой особый способ наблюдения малых созданий». В 1676 году Левенгуку удалось наблюдать микроорганизмы, но технологию подготовки стекол для своих микроскопов и способ освещения микрообъектов он сохранил в секрете, поэтому в следующий раз бактерий увидели только в XIX веке.

Говоря об истории развития микроскопии, необходимо упомянуть имя Роберта Гука (1635-1703), английского натуралиста, который, используя наблюдения Янсенов, создал сложный микроскоп, похожий по виду и устройству на современные микроскопы. Данные, полученные с его помощью, Гук опубликовал в книге «Микрография» в 1665г. Там были представлены блестящие иллюстрации живых и неживых объектов, выполненные самим автором. Но самое главное открытие, сделанное Гуком с помощью микроскопа, было описание растительных клеток. Им же был предложен термин «клетка». Надо отметить, что и Гук, и Левенгук пришли к важному выводу о том, что ключом к большим увеличениям является использование линз с очень коротким фокусным расстоянием. Дальнейшее развитие микроскопии шло медленно. С одной стороны, это было обусловлено мнением большинства натуралистов, что еще многое не исследовано и нет необходимости использования микроскопов. С другой стороны, искажения (хроматические аберрации) увеличенных с помощью микроскопа изображений были постоянным источником ошибочных интерпретаций.

Большим шагом вперед было открытие ахроматической линзы Джоном Доллондом в Лондоне в 1758 году. Математик Леонард Эйлер дал теоретическое обоснование ахроматов (систем линз со скорректированными цветами) в 1771г. и предложил расчеты таких ахроматических объективов. Они были сконструированы F.G. Beeldsnyder (1735-1808), который поместил кварцевую двояковогнутую линзу между двумя двояковыпуклыми линзами из другого типа стекла.

Amici (1786-1863) усовершенствовал ахроматические системы и разработал иммерсионные объективы. Но главным прорывом на пути к созданию современных микроскопов было формулирование дифракционной теории формирования изображения Эрнст Аббе (1840-1905). Он показал, что существует предельное оптическое разрешение микроскопа (дифракционный предел), которое составляет около 200 нм. Его теория позволила развиваться конструированию высокоэффективных микроскопов и их массовому использованию. Применение разработанных О. Schott (1851-1935) стекол привело к созданию Аббе и Цейссом апохроматических объективов, хроматические аберрации в которых были исправлены в широком диапазоне спектра. Такой прогресс в создании микроскопов позволил сделать множество открытий в гистологии, цитологии и бактериологии. Этому способствовало развитие и использование подходящих методов фиксации, срезов, специфических красителей и фиксаторов. В настоящее время с развитием техники микроскопы преобразились в целые исследовательские станции, оборудованные множеством дополнительных приспособлений, расширяющих их функциональность. Такие станции оснащаются мощными компьютерами и сложным программным обеспечением, позволяющими автоматизировать обработку и анализ микроскопических изображений.

Перечислим некоторые даты, имеющие отношение к истории микроскопа:

начало ХIII в. – Бекон описывает линзу;

ХIV в. – широкое применение очков;

1600-1605 – изобретение телескопа (многие историки науки считают, что это случайно было сделано ремесленниками, изготовлявшими очковые линзы);

1608 – применение телескопа Галилеем для научных исследований;

1610 –изобретение Галилеем микроскопа;

1610 – создание Кеплером геометрической теории микроскопа;

1665 – открытие Гуком клетки при помощи микроскопа;

1758 – Доллонд изготовил первую ахроматическую линзу;

1872 – Тимирязев соединил микроскоп со спектроскопом;

1882 – Фон Эбнер изобрел поляризационный микроскоп;

1886 – Аббе создал дифракционную теорию микроскопа, ввел понятие предела разрешающей способности и сконструировал объективы, достигшие теоретического предела разрешающей способности;

1893 – Сиркс изобрел интерференционный микроскоп;

1908 – Кёлер и Зидентопф изобрели люминесцентный микроскоп;

1934 – Цернике изобрел фазовоконтрастный микроскоп.

Отметим интересный факт из истории науки. От фундаментального открытия в биологии – открытия клетки – до понимания того, как работает прибор, с помощью которого было сделано это открытие, прошло более 200 лет!

Примечательным также является, что ядро клетки было прекрасно видно в микроскопах ХVII века, а открыли его только в 1833 году. По-видимому, это произошло из-за отношения исследователей к оптическим приборам, как к очень ненадежным помощникам. Во времена Галилея была написана книга «Натуральная магия или о чудесах вещей естественных», в которой описывались такие фокусы с линзами, которые позволяли видеть то, чего на самом деле не было. Это скептическое отношение к результатам, полученным с помощью микроскопов, сохранилось надолго. К сожалению, и в наше время недостаточная грамотность в понимании микроскопии иногда дает основания для подобного скепсиса.