По бактериологическому исследованию на дифтерию

ВЗЯТИЕ И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА

При проведении исследования на дифтерию необходимо во всех случаях брать материал из ротоглотки и носа. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, половые органы), помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа. Материал для исследования берут до начала лечения антибиотиками. Взятие мазков должно производиться специально обученным персоналом.

Для взятия материала используют сухие стерильные ватные тампоны. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном зубов, слизистой щек и языка. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с небных дужек, задней стенки глотки. При наличии налетов материал следует брать с границы здоровых и пораженных тканей, слегка нажимая на них тампоном, т.к. большинство жизнеспособных коринебактерий находится в глубоких слоях псевдомембраны, и поверхностный мазок может не содержать их.

Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При невозможности произвести доставку и посев материала в указанный срок, его необходимо засевать на чашки с питательной средой или в транспортную среду на месте взятия. Применение транспортной среды удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, однако использование питательного бульона в качестве транспортной среды позволяет применить экспресс-методы выявления дифтерийного токсина для выдачи предварительного ответа (иммуноферментный метод, реакцию непрямой гемагглютинации). При транспортировании на дальние расстояния можно использовать тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина на физиологическом растворе, pH которого доводят до 7, 6 20% раствором. В осенне-зимнее время года материал доставляют в лабораторию в термоконтейнерах.

Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос, другая локализация) придается номер. В прилагаемом сопроводительном документе указывается номер пробирки, фамилия, имя, возраст, название учреждения, направляющего материал, цель обследования (диагностическая, по эпид. показаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала.

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ ДЕНЬ

Микроскопия окрашенного по Граму мазка из нативного материала не является обязательной процедурой из-за низкой диагностической ценности. Коринебактерии дифтерии не могут быть надежно идентифицированы от сапрофитов с помощью данного метода, который также имеет низкую чувствительность. Однако его целесообразно использовать при подозрении на дифтерию редких локализаций.

1. Материал от одного лица засевают на чашку с селективной дифференциальной средой (кровяно-теллуритовым агаром), используя при этом половину чашки для посева материала из зева, а вторую половину - из носа. При обследовании на дифтерию редких локализаций, добавляется еще одна чашка для посева клинического материала. Для повышения вероятности обнаружения возбудителя первичный посев следует производить дополнительно еще на одну чашку с другой селективной средой (Тинсдаля, Бучина) и чашку с кровяным агаром. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

2. При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью приблизительно 2х1 см и затем частыми непрерывными штрихами, не изменяя положения тампона, засевают оставшуюся поверхность половины чашки.

3. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37⁰С. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей (что гораздо лучше и надежнее), взяв материал из осадка.

4. Посев следует производить на среды, согретые при комнатной температуре или в термостате. Свежеприготовленные среды необходимо подсушить в термостате 20-30 минут.

ВТОРОЙ ДЕНЬ

5. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) или лупы.

Чашки с колониями, похожими на колонии коринебактерии дифтерии, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам.

Колонии, подозрительные на принадлежность к C. diphtheria, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis, через 24 часа роста на средах с теллуритом калия имеют черный или с серым оттенком цвет, обычно мелкие, не более 2 мм в диаметре, выпуклые, вязкие или крошащиеся при прикосновении петлей. На кровяном агаре колонии серые или слегка кремовые, могут быть окружены небольшой зоной гемолиза. На среде Бучина подозрительные колонии имеют синий цвет, а среда в месте их роста приобретает фиолетовый оттенок. На агаре Тинсдаля колонии черного цвета и, в дополнение, C. diphtheria, C. ulcerans, иногда C. pseudotuberculosis образуют коричневый ореол вокруг колонии. Колонии черного цвета на средах с солями теллура могут формировать и некоторые другие бактерии (например, стрептококки и стафилококки).

6. Из сомнительных колоний готовят мазки и окрашивают их метиленовой синью Леффлера. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбирают для дальнейшей идентификации. При обнаружении кокков, дрожжей, споровых палочек дальнейшее исследование можно прекратить.

7. В случае роста подозрительных однотипных колоний необходимо приступить к их идентификации (определение токсигенных свойств, цистеназы) и выделению чистой культуры на скошенном сывороточном агаре. Токсигенные свойства изучают не менее чем у двух колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токcигенности и, необожженной петлей, на среду Пизу, а другой половиной колонии - в пробирку со скошенным сывороточным агаром для накопления чистой культуры. При невозможности снять половину колонии. Для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии; посев на скошенный агар исключается и, в дальнейшем, используется культура из пробирки с пробой Пизу или из бляшки, выросшей на среде для определения токсигенности через 48 часов роста или через 24 часа в случае выявления токсигенных свойств.

Если на чашке первичного посева вырастает множество подозрительных колоний, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа колоний (не менее 10), смешивая по 5-10 однотипных колоний в одну бляшку.

8. При наличии множественного роста подозрительных колоний, можно поставить РНГА или ИФА (после субкультивирования колоний 5-18 часов на сывороточном бульоне), использовать дополнительную пробу Заксе или индикаторный диск для определения ферментации мочевины (3-5 однотипных колоний, учет через 0, 5-2 часа инкубации) или пробу Пизу на модифицированной среде (5-6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации).

При характерной для коринебактерии дифтерии морфологии колоний, морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, положительном результате РНГА или ИФА можно выдать предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии через 36-48 часов (на третьи сутки) с момента первичного посева исследуемого материала.

9. Чашки с первичным посевом исследуемого материала после просмотра на вторые сутки, вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно.

ТРЕТИЙ ДЕНЬ

10. Через 24 часа просматривают чашки с посевами на токсигенность в проходящем свете и на темном фоне. Выделенная культура считается токсигенной, если образовавшиеся линии преципитации контрольного и исследуемого штаммов, сливаясь концами, плавно переходят одна в другую.

При наличии специфических линий преципитации, положительной пробе на цистеназу выдают документированный предварительный ответ о выделении токсигенной культуры коринебактерии дифтерии.

При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.

11. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после определения ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и ферментации мочевины.

12. Чашки с первичным посевом просматривают повторно через 36-48 часов инкубации. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При обнаружении подозрительных колоний проводят идентификацию культуры, определяют токсигенные свойства, цистеназную активность и выделяют чистую культуру (см. второй день исследования).

Иногда коринебактерии дифтерии вырастают на чашках первичного посева через 72 часа и позднее, поэтому следует осторожно относиться ко времени выдачи отрицательного ответа. Если материал для исследования был взят от больного подозрительного на дифтерию, необходимо произвести повторное взятие и исследование материала от этого больного.

Полное отсутствие роста на чашках первичного посева колоний каких-либо микроорганизмов свидетельствует о нарушении правил взятия, доставки, посева и культивирования исследуемого материала.

ЧЕТВЕРТЫЙ ДЕНЬ (или ПЯТЫЙ)

13. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты теста на токсигенность, поставленного на второй день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в тестах, поставленных на третий день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов инкубации чашек со средой для определения токсигенности, но при положительных результатах проб на цистеназу, глюкозу, отрицательных результатах ферментации сахарозы и определения уреазной активности, культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимического типа (см. таблицу 9).

В случае выделения токсигенных коринебактерий дифтерии и выдачи предварительного ответа на третий день, окончательный ответ с указанием биотипа выдается на четвертый или пятый день (через 72-96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).

Биологические свойства коринебактерий, используемые при идентификации

Таблица 9

Примечание:

+, 90% и более штаммов положительны в течение 2 дней;

-, 90% и более штаммов отрицательны;

v, более 10%, но менее 90% штаммов положительны;

*, биотип mitis включает штаммы ферментирующие сахарозу и не редуцирующие нитраты (вариант belfanti), которые встречаются редко

Таким образом, выделенные коринебактерии являются возбудителями дифтерии, если они обладают токсигенными свойствами, ферментируют глюкозу, крахмал, цистин; не ферментируют сахарозу и мочевину, а также имеют характерные морфологические и культуральные свойства.

СРОКИ ВЫДАЧИ И ФОРМУЛИРОВКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

1. Предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии, выдается через 24-48 часов с момента первичного посева исследуемого материала при характерной для коринебактерий дифтерии морфологии бактериальных клеток и морфологии колоний, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, выявлении токсина методами иммуноиндикации, в частности, РНГА, ИФА, РНАт (методика последней изложена в приложении 5 к приказу МЗ СССР 1986 г. № 450), либо при выявлении гена токсинообразования (tox -гена) с помощью геноиндикации - полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. При обследовании на бактерионосительство с профилактической целью, а также при исследовании материала из мест редкой локализации дифтерии предварительный ответ не выдается. В этих случаях выдается только окончательный ответ, основанный на идентификации выделенных культур по всем свойствам.

3. Окончательный ответ при обследовании лиц всех категорий в случае роста коринебактерии дифтерии на чашках первичного посева через 24 часа может быть выдан через 48 часов (культура токсигенная) или через 72 часа (культура нетоксигенная). В тех случаях, когда колонии на чашках первичного посева появляются позднее, чем через 24 часа, ответ выдается, соответственно, позднее (до 96 часов). При применении транспортных сред срок выдачи ответа отодвигается еще на 24 часа.

4. Формулировка окончательного ответа при положительном анализе: «Выделены токсигенные (или нетоксигенные) дифтерийные палочки». При этом указывается биохимический вариант коринебактерий дифтерии.

5. При наличии линий преципитации, идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистеназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду C. ulcerans, токсигенный вариант (см. таблицу 9). Эти штаммы следует направлять в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения.

В случае идентификации C. ulcerans, нетоксигенный вариант, выдают отрицательный ответ. Обнаружение коринебактерий Гофмана или других дифтероидов также дает возможность считать ответ отрицательным.

6. Во всех случаях обнаружения дифтерийных палочек лаборатория обязана известить учреждение, из которого был доставлен материал, и районного эпидемиолога.

7. При передаче ответа по телефону необходимо записывать дату передачи и фамилии лиц, передавших и принявших телефонограмму.