Методики постановки иммуноферментного анализа и реакции непрямой гемагглютинации для выявления дифтерийного токсина

Для решения задачи эпиднадзора за дифтерийной инфекцией необходим качественно новый подход к лабораторной диагностике дифтерии - сокращение сроков исследования, применение более надежных и специфических методов исследования.

Совершенно очевидно, что для сокращения сроков диагностики дифтерийной инфекции необходимо подходить не с позиции выявления коринебактерий дифтерии (токсигенных и нетоксигенных), а с позиций индикации патогенного агента возбудителя дифтерии - дифтерийного токсина.

При определении дифтерийного токсина методом ИФА применяется твердофазнй вариант. Далее приводится описание метода с использованием моноклональных антитоксических противодифтерийных антител (МкАт), полученных к COOH-концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, ответственного за биологическое связывание с клетками макроорганизма, и иммобилизированных на полистироле. Используются также поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела (ПкАт), меченые ферментом пероксидазой хрена. Сорбированные на поверхности полистироловых планшетов МкАт связывают находящиеся в исследуемых пробах молекулы дифтерийного токсина (анатоксина) и не связывают никаких других продуктов микробного или иного происхождения, обеспечивая тем самым исключительно высокую специфичность метода. Свободные антигенные детерминанты молекулы токсина взаимодействуют с ПкАт, конъюгированными с пероксидазой хрена. При наличии в анализируемых пробах токсина образовавшийся комплекс моноклональные антитела - дифтерийный токсин - поликлональный конъюгат с пероксидазой проявляются индикаторной субстратной смесью перекиси водорода с 5-аминосалициловой кислотой (рисунок 2).

Учет реакции производят визуально или инструментально по изменению цвета субстратной смеси. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяет выявить токсин в концентрации 4-8 нг/мл или 0, 002 Lf/мл анатоксина. Значительным преимуществом ИФА является возможность индикации токсина непосредственно в жидкой питательной среде, в которую был произведен посев клинического образца, минуя этап выделения чистой культуры. Этот метод можно использовать как для качественного (по принципу «да - нет»), так и количественного определения дифтерийного токсина. Пробы ставят в дубликатах - по 2 лунки для каждой пробы.

Схема проведения иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления

дифтерийного токсина

Рисунок 2

Ат Аг Ат Аг Ат Е

Ат Аг Ат Ат Е Е

отмывка

ИЗМЕРЕНИЕ

ПРОДУКТА СУБСТРАТ Е Ат Аг Ат

РЕАКЦИИ

отмывка Ат

Условные обозначения: АТ - иммобилизированные антитоксические противодифтерийные антитела; АГ - определяемый антиген (дифтерийный токсин); АтЕ - конъюгат (антитоксические антитела - фермент)

РНГА - двухкомпонентная реакция, предполагает использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином - анатоксином. Учитывая возможность появления неспецифической агглютинации в первых лунках планшетов за счет высокой концентрации белка, при постановке РНГА все исследуемые пробы анализируются в серийных разведениях. При наличии в исследуемой пробе токсина, образуется специфический комплекс дифтерийный токсин - сенсибилизированные эритроциты - антитоксические антитела, формирующий осадок в виде агглютината эритроцитов. Чувствительность практически не уступает ИФА.

Сравнительное испытание методов - реакции преципитации в агаре (метод традиционной бактериологии), РНАт, ИФА, РНГА показало преимущество ИФА и РНГА по чувствительности, специфичности, времени проведения анализа. ИФА и РНГА позволяют выдать ответ о наличии токсина или его отсутствии в исследуемом материале на 1-3 суток раньше традиционных методов. Чувствительность ИФА и РНГА зависит от условий культивирования исследуемого материала. Использование жидкой питательной среды позволяет выявить токсин у слаботоксигенных штаммов, продукцию которого уловить на плотной питательной среде, при постановке менее чувствительной реакции иммуно-преципитации в агаре, не всегда представляется возможным.

ИФА и РНГА могут быть применены для ускоренного выявления токсина в материале от больных дифтерией, носителей токсигенных коринебактерий дифтерии; от лиц, обследуемых с профилактической целью или по эпидемическим показаниям; а также - в культурах, выделенных на разных этапах бактериологического исследования. Кроме того, они позволяют изучить уровень токсинообразования штаммов коринебактерий дифтерии. Эти методы могут быть реализованы в бактериологических, диагностических лабораториях СЭО.

Иммуноферментный анализ

Для проведения исследований необходимы:

n коммерческая тест-система иммуноферментная моноклональная для определения дифтерийного токсина «Дифтерия-Монозим» (изготовитель - фирма «Илья Мечников» при ЦНИИВС им. И.И.Мечникова, 103064, Москва, пер. Мечникова, 5а, тел. 916-03-20);

n пипеточные дозаторы или автоматические пипетки на 100 мкл или 200 мкл (импортные или отечественного производства);

n термостат 37^{0 С};

n мерная посуда (химически чистая);

n фильтровальная бумага;

n дистиллированная вода;

n 0, 85% раствор хлорида натрия, pH 7, 2;

n 4% раствор гидроксида натрия (NaOH);

n 3% раствор перекиси водорода (H₂O₂);

n в случае необходимости инструментального учета - вертикальный фотометр для оценки иммуноферментных реакций в 96-луночных планшетах с фильтром 450 нм.

Общий принцип постановки ИФА описан на примере коммерческого набора «Дифтерия-Монозим». При использовании других коммерческих тест-систем вносят коррективы согласно инструкции применения этих систем.

Набор «Дифтерия-Монозим» содержит:

1) моноклональные антитела для адсорбции на планшетах;

2) конъюгат антитоксический поликлональный - меченные пероксидазой хрена ПкАт;

3) положительный контроль - анатоксин дифтерийный, 300 Lf/мл;

4) отрицательный контроль - среда культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерии дифтерии;

5) 5-АС - 5-аминосалициловая кислота (индикатор);

6) твин-20 - детергент для приготовления промывающего раствора;

7) планшеты полистироловые (обязательно плоскодонные в случае инструментального учета результата) для иммуноферментных реакций одноразового пользования.

8)