Среды для определения биохимических свойств

Среды для определения цистиназной активности

Среда Пизу на Мартеновском агаре

К 90 мл расплавленного 1, 5%-ного мартеновского агара (не допускается использование агара Хоттингера), pH 7, 6, добавляют 2 мл 1%-ного раствора L-цистина в 0, 1 N растворе соляной кислоты (HCl), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0, 1 N раствора NaOH. Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы, можно использовать фиксанально выпускаемые предприятиями химической промышленности.

Среду стерилизуют при температуре 112⁰ в течение 30 мин, можно сохранять в течение 1 месяца при 4⁰.

Агар с цистином расплавляют при 90⁰ (не кипятят) для сохранения цистина. К охлажденной до 45⁰ среде добавляют 1 мл 10%-ного раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота с соблюдением правил асептики и разливают по пробиркам.

Необходимо учитывать, что при температуре среды 50⁰ и выше, в присутствии уксуснокислого свинца, сыворотка мутнеет и среда приобретает молочный цвет. Это затрудняет учет результатов реакции.

Среда Пизу на основе коммерческой среды АГВ

Для приготовления среды Пизу можно использовать доступную и сбалансированную по составу коммерческую среду АГВ, применяемую в бактериологической практике для определения чувствительности микроорганизма к антибиотикам. Навеску сухой среды АГВ в количестве 2, 7 г вносят в 90 мл дистиллированой воды и кипятят ее до полного растворения. Готовят 5%-ный раствор гидрокарбоната натрия. Для этого растворяют 0, 5 г NaHCO₃ в 10 мл дистиллированной воды. В 10 мл гидрокарбоната натрия внося 0, 1 г L-цистина и кипятят до полного растворения цистина. Затем 2 мл кипящего щелочного раствора цистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят pH до 7, 6 и стерилизуют при 112⁰ в течение 10 мин. К расплавленной и охлажденной до 45⁰ основе последовательно добавляют: 10 мл сыворотки крупного рогатого скота, 1 мл 10%-ного раствора уксуснокислого свинца, 1, 5 мл стерильного свежеприготовленного 10%-ного раствора гипосульфита натрия и разливают по пробиркам.

Растворы уксуснокислого свинца и гипосульфита натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане в течение 30 мин.

Среды для определения уреазной активности

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе.

Бульон с мочевиной

К 100 мл стерильного мясо-пептонного или бульона Хоттингера (pH 7, 0) добавляют 1 г мочевины и 0, 2 мл 1, 6%-ного спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки и стерилизую текучим паром в течение 10 мин.

Приготовление реактивов для определения

уреазной активности по методу Заксе

Готовятся 2 реактива – А и В.

Реактив А:

Мочевина................................................................................................2 г

96%-ный этиловый спирт..................................................................... 2 мл

Дистиллированная вода.........................................................................4 мл

Реактив В:

0, 2%-ный раствор фенолрот..................................................................1 мл

Однозамещенный фосфат калия (KH₂PO₄)............................................0, 1 г

Двузамещенный фосфат калия (K₂HPO₄)..............................................0, 1 г

Хлорид натрия.....................................................................................0, 5 г

Дистиллированная вода.....................................................................100 мл

Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре 4⁰. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.

Среда для определения сахаролитической активности

Для определения сахаролитической активности рекомендуется использовать питательную среду на 1%-ной пептонной воде.

К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0, 5 мл химически чистого NaCl и 1 мл индикатора Андреде. Устанавливают pH 7, 4, кипятят 5 мин, фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют один из углеводов: сахароза, глюкоза (в количестве 1 г), растворимый крахмал (0, 5 г).

Среды разливают в пробирки по 2-3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 мин или при 0, 5 атм 30 мин. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветны или имеют слегка розоватый оттенок.

Индикатор Андреде

Посуда для приготовления индикатора должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой.

К 100 мл дистиллированной воды добавляю 0, 5 г кислого фуксина и 16, 4 мл 4%-ного раствора NaOH. Раствор на сутки оставляют при 37⁰, периодически встряхивая, 2-е суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный раствор имеет соломенно-желтый цвет или слегка розовый оттенок, который исчезает в процессе хранения. Интенсивно розовая окраска раствора в процессе приготовления индикатора указывает на необходимость увеличения содержания щелочи до 18 мл.

Среда для определения нитратредуктазной активности

К 100 мл питательного бульона (МПБ или бульона Хоттингера) pH 7, 3-7, 5, свободному от нитритов (проверить реактивом Грисса или Касаткина), прибавляют 0, 1 г свободного от нитритов нитрата калия (KNO₃). Проверяют еще раз на наличие нитритов и разливают по 2 мл в пробирки, предварительно тщательно промытые проточной водой. Среды стерилизуют 15 мин при 120⁰.

Реактив Грисса

Раствор 1. 0, 8%-ная сульфаниловая кислота в 5 N уксусной кислоте.

Раствор 2. 0, 6%-ная диметил-альфа-нафталамин в 5 N уксусной кислоте.

Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин, бесцветен, при появлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранят при 4⁰ в течение 2 месяцев.

Реактив Касаткина

Раствор 1. 0, 1%-ный раствор риванола в дистиллированной воде.

Раствор 2. 12%-ный раствор соляной кислоты (HCl).

Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин, бесцветен, при появлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранят при 4⁰ в течение 2 месяцев.