Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННЫХ СВОЙСТВ КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител (антитоксин) в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на полоску фильтровальной бумаги, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или “усов”.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии, культура со скошенного агара или из пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, могут также быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитата в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном, питательную среду – агар Мартена или сухую коммерческую среду, стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 1, 5 х 8 см, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота, противодифтерийную антитоксическую сыворотку или ферментированным и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (антитоксин диагностический дифтерийный очищенный, сухой, изготовитель – НПО “Биомед”, 614099, Пермь, ул. Братская 177, тел. 48-57-22), контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии 24–48-часового роста (для постановки пробы на токсигенность пересевается в условиях лаборатории каждые сутки).

Приготовление чашек со средой для постановки пробы на токсигенность

При небольшом объеме работы питательный агар для определения токсигенности коринебактерий дифтерии целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). Питательный агар, разлитый во флаконы, требует многократного расплавления, а длительное термическое воздействие значительно ухудшает его качества. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90⁰ С, тотчас вынимают из бани, охлаждают до 50⁰ С и добавляют 20% сыворотки крови крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крови крупного рогатого скота, перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки. В центр чашки, на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают фильтровальную бумажку, пропитанную противодифтерийной антитоксической сывороткой или очищенным антитоксином. Чашку просушивают в термостате при 37⁰ С в течение 15–20 мин, повернув ее вверх дном.

Чашки со средой для определения токсигенности (без фильтровальной бумажки) можно хранить в холодильнике в течение одних суток.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером 1, 5 х 8 см, заворачивают по 2–4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин. Сохраняют пакетики с бумажными полосками в стерильной чашке Петри до 3-х недель.

Перед постановкой пробы на токсигенность фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри. На каждую полоску наносят 0, 25 мл противодифтерийной антитоксической сыворотки или очищенного антитоксина, активностью 500 МЕ в 1 мл. Для удаления избытка сыворотки полоску прикладывают к стерильной чашке Петри.

Разведение противодифтерийной антитоксической сыворотки

Соблюдая правила асептики, противодифтерийную антитоксическую сыворотку или очищенный антитоксин переносят из ампул в стерильную пробирку. На пробирке указывают данные этикетки и срок хранения. Хранят сыворотку в холодильнике.

Сыворотка должна быть разведена стерильным физиологическим раствором до содержания 500 МЕ в 1 мл. Коммерческий препарат “Противодифтерийная антитоксическая сыворотка” может иметь различную активность (5000 МЕ, 10000 МЕ, 20000 МЕ) и различный объем.

Примеры разведения сыворотки

Пример 1. В ампуле содержится 10000 МЕ (в объеме 4, 8 мл, как указано на этикетке коробки с ампулами), противодифтерийной антитоксической сыворотки. Для упрощения расчетов общий объем сыворотки можно принять за 50 мл. Следовательно, в 1, 0 мл сыворотки содержится 2000 МЕ (10000 МЕ: 5 = 2000 МЕ). Чтобы получить 500 МЕ в 1 мл, следует 1 мл сыворотки развести в 4 раза, т.е. к 1 мл сыворотки добавить 3 мл стерильного физиологического раствора. При необходимости можно развести сыворотку в меньших объемах: к 0, 1 мл сыворотки добавить 0, 3 мл физиологического раствора или к 0, 2 мл сыворотки добавить 0, 6 мл физиологического раствора и т.д.

Пример 2. Разведение сыворотки можно выполнить другим способом. Если, например, в ампуле содержится 5000 МЕ сыворотки в объеме 2, 5 мл, то 500 МЕ содержится в 0, 25 мл сыворотки. К этому объему добавляют 0, 75 мл стерильного физиологического раствора и получают разведение 500 МЕ в 1 мл.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин разведения не требует, т.к. в 1 мл этого препарата содержится 500 МЕ.

На пропитывание одной полоски фильтровальной бумаги требуется 0, 25 мл сыворотки (100-125 МЕ). Разведенную сыворотку можно хранить до 7 дней в холодильнике.