Методика постановки реакции пассивной

гемагглютинации для выявления дифтерийных антитоксических антител (РПГА)

(В СООТВЕТСТВИИ С МЕТОДИЧЕСКИМИ УКАЗАНИЯМИ. МУ 4.2.698-98" УТВ. МИНЗДРАВОМ РФ 09.01.98)

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в РПГА. РПГА – двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами – дифтерийным и столбнячным. Данную реакцию ставят микрометодом, при котором используются малые количества сыворотки крови, растворов и реактивов. Также, по сравнению с макрометодом, микрометод более чувствителен и специфичен. Описанная в данном разделе методика постановки РПГА содержит основные требования, предъявляемые к этой реакции.

Взятие крови для постановки РПГА осуществляют обученные медицинские работники ЛПУ. Кровь берут из пальца в объеме 0, 7–1, 0 мл. Не допускается взятие крови из вены специально для постановки РПГА. Вместе с тем, возможно использование крови, взятой из вены для проведения комплексных исследований. Постановку РПГА должен осуществлять специально обученный персонал.

ПРАВИЛА СБОРА И ОБРАБОТКИ ПРОБ КРОВИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКИХ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНЫХ И ПРОТИВОСТОЛБНЯЧНЫХ АНТИТЕЛ

Обследуемый тщательно моет руки с мылом в теплой воде. Подушечку концевой фаланги безымянного пальца левой руки обрабатывают 70 % спиртом, место сгиба у концевой фаланги прижимают для лучшего кровенаполнения и наносят два укола стерильным одноразовым скарификатором на расстоянии 2 мм один от другого или один укол двумя скарификаторами взятыми вместе. Массируя опущенный палец, капли крови собирают в стерильную центрифужную пробирку, направляя их " одной дорожкой". Собирают не менее 0, 7–1, 0 мл крови. Ранку обрабатывают настойкой йода. Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и оставляют в наклонном положении для образования " скошенного" сгустка. На пробирке должен быть указан номер, соответствующий записи в журнале регистрации. Через час пробирку переводят в вертикальное положение. При этом сгусток остается на стенке пробирки, а свободная от эритроцитов сыворотка собирается на дне. Сыворотку переносят в другую пробирку.

В лабораторию для постановки РПГА доставляют либо пробирку со сгустком, либо пробирку с сывороткой. Сыворотка может быть заморожена и храниться при температуре 20⁰ C. Замораживать и оттаивать сыворотку крови рекомендуется не более одного раза.

ОСНАЩЕНИЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РПГА

(На примере коммерческой тест-системы производства

АО " Биомед" им. Мечникова, п. Петрово-Дальнее Московской обл.)

Для проведения реакции микрометодом необходимы:

– коммерческий набор для определения противодифтерийных антитоксических антител " Диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий для РПГА";

– мерная посуда;

– капельницы, петли из набора Такачи объемом 0, 025 мл (возможна постановка реакции петлями объемом 0, 05 мл, что предполагает увеличение расхода диагностикума и других компонентов реакции в два раза) или автоматические пипетки, установленные на объем 25 мкл (или 50 мкл);

– полистироловые планшеты " U" - образные (со сферическим дном) из набора Такачи или отечественного производства для иммунологических реакций (многократного использования);

– дистиллированная вода;

– 0, 85-процентный свежеприготовленный раствор хлорида натрия – для разведения испытуемых сывороток.

Коммерческая тест-система содержит:

n Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный, без твина (ФБР без твина) – для разведения диагностикума и контрольных эритроцитов.

n Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный, с твином (ФБР с твином) – для разведения сыворотки противодифтерийной контрольной и проведения РПГА.

n Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3-процентный.

n Эритроциты барана формалинизированные 50-процентные – для адсорбции гетерогемагглютининов в испытуемых сыворотках.

n Эритроциты барана контрольные 3-процентные.

n 6. Сыворотка противодифтерийная контрольная, содержащая 10 ME/мл.

ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ

МАТЕРИАЛА В РПГА

1. Подготовка планшетов и др. (см. " Меры безопасно_ти при постановке РНГА", раздел 6). Перед проведением реакции протирают каждую лунку тампоном, смоченным разведенным ФБР с твином.

2. Приготовление раствора ФБР без твина. Содержимое флакона " ФБР без твина" разводят до объема 62, 5 мл дистиллированной водой (pH готового раствора 7, 2). Приготовленный раствор используют в день проведения реакции.

3. Приготовление раствора ФБР с твином. Содержимое флакона " ФБР с твином" разводят до объема 125 мл дистиллированной водой (pH готового раствора 7, 2). Разведенный раствор можно разлить по флаконам, герметически укупорить и хранить при температуре 4⁰ C в течение 72 часов.

4. Приготовление раствора противодифтерийной контрольной сыворотки (СДК). Сыворотку противодифтерийную контрольную (10 ME/мл) разводят в 100 раз до содержания 0, 1 ME/мл с помощью ФБР с твином. СДК должна быть использована в течение суток.

5. Приготовление рабочего разведения диагностикума эритроцитарного дифтерийного (ДЭД). Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3-процентный разводят ФБР без твина до 0, 3-процентной концентрации.

6. Приготовление рабочего разведения эритроцитов барана контрольных (КЭ). Контрольные эритроциты 3-процентные разводят до 0, 3-процентной концентрации с помощью ФБР без твина.

7. Подготовка исследуемых сывороток. Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня дифтерийного антитоксина разводят 1: 5 или 1: 10 0, 85-процентным свежеприготовленным раствором хлорида натрия. Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин. в водяной бане или инактиваторе при температуре 56⁰ C. Разведенную и прогретую сыворотку адсорбируют эритроцитами барана, формалинизированными 50-процентными, которые перед использованием встряхивают до получения гомогенной взвеси. Эритроциты добавляют из расчета 0, 05 мл на 0, 5 мл разведенной сыворотки, выдерживают 15–20 часов при температуре 4⁰ C. После сорбции прозрачная надосадочная жидкость готова к исследованию (без предварительного центрифугирования). При срочном исследовании адсорбцию проводят в течение 30 мин. в термостате при 37⁰ C, центрифугируют и работают с надосадочной жидкостью.

ПОСТАНОВКА РПГА

1. Внесение ФБР с твином. Во все лунки планшета вносят по 0, 025 мл разведенного ФБР с твином.

2. Внесение испытуемых сывороток. Петлей вместимостью 0, 025 мл в 1 лунку ряда вносят 0, 025 мл разведенной 1: 5 прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1: 10 и, перенося по 0, 025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из 10 лунки, после перемешивания, удаляют 0, 025 мл. Для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках по короткому ряду планшета. Если испытуемые сыворотки разведены 1: 10, то в 1 лунку планшета вносят по 0, 025 мл разведенной 1: 10 испытуемой сыворотки. Внесение сыворотки в этом случае осуществляют мерной пипеткой (с наконечником). Титрование сыворотки начинают со 2 лунки. Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА " по длинному ряду", в 1 лунку петлей вносят 0, 025 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1: 10 (или 1: 5), перемешивают и переносят 0, 025 мл в 12 лунку. Из 12 лунки, после перемешивания, удаляют 0, 025 мл. При титровании " по короткому ряду" этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенных рядах этого же планшета (в редких случаях – в отдельном планшете).

3. Внесение сыворотки противодифтерийной контрольной (для оценки чувствительности эритроцитарного диагностикума). В 1 лунку ряда вносят 0, 025 мл разведенной СДК, получают разведение 1: 200, содержимое лунки тщательно перемешивают петлей и, перенося по 0, 025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из десятой лунки, после перемешивания, удаляют 0, 025 мл, 11 и 12 лунки, содержащие по 0, 025 мл разведенного ФБР с твином, являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации. В 1 лунку ряда, так же как и при титрировании испытуемых сывороток, лучше не вносить 0, 025 мл разведенного ФБР с твином. При этом, в 1 и 2 лунки мерной пипеткой с наконечником вносят по 0, 025 мл СДК, разведенной 1: 100. Титрование СДК начинают со 2 лунки. Контроль на чувствительность диагностикума следует ставить при каждом опыте!

4. Внесение контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА " по длинному ряду", в 11 и 12 лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0, 025 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА " по короткому ряду", контрольные эритроциты барана вносят в две специально выделенные лунки для каждой испытуемой сыворотки (см. п. 2).

5. Внесение эритроцитарного диагностикума. Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и капельницей вносят по 0, 025 мл (одна капля) диагностикума в каждую лунку до конца ряда с разведениями контрольной сыворотки и с 1 до 10 лунки включительно с разведениями испытуемых сывороток (или с 1 до 8 лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции " по короткому ряду". Разведенный диагностикум может быть использован в течение недели, если его активность соответствует требуемой. Равномерное распределение эритроцитов в лунках пластин достигается путем постукивания по углам пластины. Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2, 5–3, 5 часов при температуре 20⁰ C (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Допускается учет результатов реакции через 18–24 часа.

Примечание. Титрование сывороток можно проводить в объеме 0, 05 мл, диагностикум при этом добавляют по 0, 025 мл в каждую лунку.

УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты РПГА оценивают визуально – по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

– осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.

Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: то есть повторно провести обработку сыворотки 50-процентными формалинизированными эритроцитами. За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два плюса (++). При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума, агглютинация на два плюса с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1: 3200 и не выше 1: 12800, что соответствует 5–7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже, чем 1: 1280.)

Условно–защитным титром как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител принимается титр 1: 20. Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1: 20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1: 5 или 1: 10, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки, ее вноe2ь разводят 1: 5 или 1: 10, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.

Сравнение количественных показателей содержания антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови, полученных с помощью титрования в РПГА и в коже кролика, не представляется возможным.

Не рекомендуется использовать РПГА для дифференциальной диагностики дифтерийной инфекции и носительства токсигенных коринебактерий дифтерии, поскольку нарастание титра антитоксических антител может иметь место как в том, так и в другом случае. Кроме того, 4-кратного нарастания титра реакции, которое некоторыми исследователями трактуется как критерий наличия дифтерийной инфекции, может не наблюдаться, поскольку РПГА является полуколичественным методом, с допустимой ошибкой метода +/- одно разведение. Однако РПГА позволяет оценить состояние антитоксического противодифтерийного иммунитета у больного и, в некоторой степени, прогнозировать течение и исход заболевания.