Определение холестерина ферментативным методом

Принцип метода. Определение холестерина в сыворотке крови основано на использовании сопряженных ферментативных реакций. При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазыс образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы пероксид водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Диагностическое значение определения холестерина:

Общий холестерин. Гиперхолестеринемия наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, гипотиреозе, механической желтухе, нефрозах, болезни Иценко-Кушинга. Гипохолестеринемия обнаружена при гипертиреозе, туберкулезе, анемии, голодании, паренхиматозной желтухе, при аддисоновой болезни, врожденных гемолитических анемиях, острых панкреатитах, полиневритах, колитах, при расстройствах питания. При заболеваниях печени снижается количество эфирносвязанного холестерина. При этом падение пропорционально степени нарушения функции печени.

a-холестерин. Снижение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности наблюдается у лиц с ишемической болезнью сердца, обусловленной коронарным атеросклерозом. Каждый из известных факторов риска атеросклероза и ИБС сопряжен со снижением a -холестерина. У лиц с наследственной гипер- a -холестеринемией реже, чем у остальных наблюдается инфаркт миокарда и ИБС.

Вопросы к защите лабораторной работы:

1. Что такое холестерин?

2. Объясните принцип метода определения общего холестерина.

3. Что такое α -холестерин?

4. Каков принцип метода определения холестерина ЛПВП?

5. Как рассчитывается коэффициент атерогенности? Какую информацию он дает врачу?

6. Для диагностики каких заболеваний используется определение холестерина?

7. Почему определение общего холестерина могуло бы помочь установить гипотиреоз у детей?

8. Почему при сахарном диабете повышен холестерин крови?

9. Назовите патологии, при которых снижен холестерин крови.

10. Почему повышение ЛПНП тесно связано с гиперхолестеринемией?

5.4. Итоговый контроль знаний:

- вопросы по теме занятия:

1. Напишите в формулах синтез холестерина.

2. Назовите ключевые ферменты синтеза холестерина. Как они регулируются?

3. В каких тканях синтезируется холестерин? Есть ли другие источники холестерина в организме?

4. Какова биологическая роль холестерина?

5. Что такое липопротеины? Дайте их классификацию.

6. Дайте характеристику липопротеинам (состав, место синтеза, функции).

7. Какие липопротеины являются атерогенными?

8. Каким образом ЛПВП могут освобождать клетки от избытка холестерина?

9. Что такое НЭЖК? Назовите источники НЭЖК и пути их использования?

10. Дайте понятие об атеросклерозе. Каковы биохимические причины этого заболевания? Назовите факторы риска для развития атеросклероза.

11. Что такое ожирение? Каковы его причины?

12. Что такое липидозы? Какие липидозы вы знаете? Дайте им характеристику?

13. Что такое сложные липиды? Приведите примеры.

14. Расскажите о переваривании сложных липидов в ЖКТ.

15. Дайте представление о синтезе сложных липидов в организме.

- ситуационные задачи:

1. Можно ли снижением потребления холестерина вызвать снижение его концентрации в крови?

2. Для чего больному атеросклерозом при выписке из больницы рекомендуют диету, стимулирующую отток желчи и усиление перистальтики кишечника?

3. Для чего больному атеросклерозом при выписке из больницы рекомендуют диету, стимулирующую отток желчи и усиление перистальтики кишечника?

ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ КОНЕЧНОГО УРОВНЯ ЗНАНИЙ

1. ПРИ ОКИСЛЕНИИ ГЛИЦЕРИНА ДО УГЛЕКИСЛОГО ГАЗА И ВОДЫ ОБРАЗУЕТСЯ

1) 3 АТФ

2) 21 АТФ

3) 36 АТФ

4) 40 АТФ

2. ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКЕ ЛОКАЛИЗОВАНО

1) в лизосомах

2) в митохондриях

3) в ядре

4) в эндоплазматическом ретикулуме

3. АКТИВНАЯ ЖИРНАЯ КИСЛОТА – ЭТО

1) ее тиоэфир

2) фосфорный эфир

3) метилированное производное

4) аденилированный продукт

4. β - ОКИСЛЕНИЕ СТЕАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРОИЗОЙДЕТ ЗА

1) 9 витков

2) 8 витков

3) 3 витка

4) 17 витков

5. СИНТЕЗ СТЕАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРОИСХОДИТ ЗА

1) 7 витков

2) 8 витков

3) 13 витков

4) 18 витков

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия (см. контрольные вопросы, тестовые задания и ситуационные задачи занятия №12).

7.Рекомендации по выполнению НИРС, в том числе список тем, предлагаемых кафедрой:

Подготовить презентацию данной темы. Для презентации рекомендуется использовать учебную и научную литературу, а также материалы сайтов Интернета. Приветствуются авторские разработки в виде схем, анимаций, видеороликов.

1. Занятие №12

Тема: «Патологии липидного обмена. Контрольная работа по теме «Обмен липидов».

2. Форма организации занятия: лабораторное занятие.

3. Значение изучения темы: Знание химического состава и свойств мембран необходимо для понимания их биологической роли, механизмов возникновения заболеваний, связанных с патологическими изменениями мембран.

1. Цели обучения:

- общая:

Обучающийся должен обладать следующими общекультурными компетенциями (ОК): (ОК-1); (ОК-5).

Обучающийся должен обладать следующими профессиональными компетенциями (ПК): (ПК-2); (ПК-3); (ПК-4); (ПК-5); (ПК-9); (ПК-17); (ПК-18); (ПК-31); (ПК-32).

- учебная:

знать:

- Виды биологических мембран и их функции.

- Химический состав и строение липидного бислоя, мицеллы, липосом.

- Свойства мембран (асимметрия, жидкостность, самосборка).

- Виды транспорта через мембраны. Разновидности ионных каналов.

Механизм действия Nа/К-АТФазы.

- Механизмы мембранной рецепции.

- Причины нарушения структуры и функции мембран. Перекисное окисление мембранных липидов.

- Механизмы антиоксидантной защиты.

уметь:

- Объяснить особенности химического состава и биологические функции биологических мембран.

- Объяснить изменения функций мембран, возникающие вследствие усиления процессов перекисного окисления липидов.

- Обосновать использование антиоксидантных препаратов, стабилизирующих мембраны.

- Объяснить изменения метаболизма, возникающие при нарушении мембранного транспорта или мембранной рецепции.

владеть:

- Навыками лабораторного дела.

5. План изучения темы:

5.1. Контроль исходного уровня знаний:

ТЕСТЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИСХОДНОГО УРОВНЯ ЗНАНИЙ

1. МЕМБРАНЫ УЧАСТВУЮТ

1) в передаче информации сигнальных молекул

2) в регуляции метаболизма в клетках

3) в переносе АТФ из цитозоля клеток в митохондриальный матрикс

4) в межклеточных контактах

2. ВЫБЕРИТЕ ОДИН НАИБОЛЕЕ ПОЛНЫЙ ОТВЕТ

МЕМБРАНЫ УЧАСТВУЮТ В

1) транспорте глюкозы в клетку

2) регуляции переноса К+ в клетку

3) секреции инсулина β - клетками островков Лангерганса

4) переносе веществ в клетку и из клетки

5) поглощении липопротеинов из крови

3. В СОСТАВ МЕМБРАН ВХОДЯТ

1) гидрофобные белки

2) эфиры холестерола

3) амфифильные липиды и белки

4) сфингозин

5) триацилглицерол

4. ВЫБЕРИТЕ ОДИН НЕПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ.

ЛИПИДЫ МЕМБРАН

1) формируют двойной липидный слой

2) участвуют в активации мембранных ферментов

3) могут служить «якорем» для поверхностного белка

4) представлены глицерофосфолипидами и сфинголипидами

5) закрепляются в мембране с помощью дисульфидных связей

5. ВЫБЕРИТЕ ОДИН НЕПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ.

ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ МОЖЕТ

1) превращаться в фосфатидилинозитол-4, 5- бисфосфат

2) выполнять «якорную» функцию для некоторых поверхностных белков

3) служить субстратом для фосфолипазы

4) в фосфорилированной форме участвовать в передаче гормональных сигналов

5) регулировать поток Сa²⁺ из эндоплазматического ретикулума в цитозоль клетки

Основные понятия и положения темы

В формировании структуры и обеспечении функциональной активности клеточных мембранбольшую роль играют липиды. Липиды участвуют выполнение двух основных функций клеточных мембран – барьерной и каталитической. В состав мембран входят фосфоглицериды (одна из гидроксильных групп глицерола этерифицирована фосфорной кислотой, а одна или обе оставшиеся ОН-группы – жирными кислотами), а также неглицероловые липиды (сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды).

Присутствие различных фосфолипидов определяет тканеспецифичностьмембран. Например, в мембранах клеток эпителия альвеол легкочной ткани содержится специфический фосфатидилхолин, у которого в первом и втором положении глицерина этерифицирована пальмитиновая жирная кислота. Такой дипальмитоилфосфатидилхолин является сурфактантом(снижает поверхностное натяжение стенок альвеол, т.е. препятствует их спадению при выдохе). Нарушение синтеза сурфактанта приводит к развитию острой дыхательной недостаточности (респираторный дистресс-синдром).

Фосфолипиды в мембранах асимметричны: на внешней стороне цитоплазматической мембраны находятся сфингомиелин и фосфатидилхолин, а на внутренней (обращенной к цитоплазме) – фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин (самый гидрофильный из всех фосфолипидов). Такая асимметрия обеспечивается АТФ-зависимой аминофосфолипидтранслоказой.

Непрерывность фосфолипидного слоя определяет барьерную и регуляторную функцию мембраны. Фосфолипиды мембран относятся к жидким кристаллам, которые находятся при физиологических условиях в жидком агрегатном состоянии, поэтому модель мембраны сравнивают иногда с фосфолипидным морем, по которому плавают белковые «айсберги» (жидкостно-мозаичная модель мембраны), причем некоторые из этих белковых молекул «заякорены» к белкам цитоскелета. В разных мембранах соотношение между количеством белков и липидов очень колеблется, кроме того, в мембранах присутствует холестерин, гликолипиды, гликопротеины.

Жидкокристаллические свойства мембранных фосфолипидов придают им определенную внутримолекулярную подвижность. Для нормального функционирования мембрана должна быть в жидкокристаллическом состоянии. Молекулы холестерина необходимы в мембране для того, чтобы упорядочиваться структуру мембраны в жидкокристаллическом состоянии и разупорядочивать ее в гель-состоянии, что уменьшает неблагоприятные последствия фазового перехода в мембранах.

5.3. Самостоятельная работа по теме:

На данном занятии студенты делают доклады с презентациями по предложенным темам.

5.4. Итоговый контроль знаний:

- вопросы по теме занятия:

1. Перечислите основные компоненты биологических мембран и их функциональное значение.

2. Какими факторами обусловлена избирательная проницаемость мембран?

3. Чем обусловлена асимметрия мембран и какова ее роль?

4. Что такое активный транспорт веществ через мембраны? Привести конкретные примеры.

5. В чем сущность процессов эндоцитоза, экзоцитоза, гетерофагии, аутофагии, секреции.

6. Как осуществляется передача сигнала через клеточную мембрану? Перечислите соединения, являющиеся мессенджерами различных систем.

7. Перечислите стадии перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран.

8. Роль ПОЛ в повреждении клетки.

9. Приведите примеры заболеваний, в основе которых лежит нарушение мембранных структур.

- вопросы рубежного контроля:

1. Дайте определение липидов, классифицируйте их.

2. Какие функции выполняют жиры?

3. какие функции выполняют липоды?

4. Расскажите о строении и функциях триациглицерина.

5. Что такое стерины и стериды? Их строение и свойства.

6. Расскажите о фосфолипидах, их строении и свойствах.

7. Какое строение имеют гликолипиды? Их значение в организме.

8. Как перевариваются жиры в пищеварительном тракте? Что требуется для этого процесса?

9. Что такое холецистокинин? Какое значение в переваривании липидов он имеет?

10. Какое значение имеют желчные кислоты в переваривании жира?

11. Назовите конечные продукты переваривания жира. Как они всасываются?

12. Что такое ресинтез жира? Какое значение он имеет?

13. Что такое хиломикроны? Где и зачем они образуются?

14. Назовите пути метаболизма хиломикронов.

15. Что такое липолиз? Напишите его в формулах. Назовите ключнвые ферменты. Как регулируется липолиз, какое значение он имеет?

16. Что такое липогенез? Ход реакций, регуляция, значение.

17. Какие жировые депо в организме вы знаете? Какое значение они имеют?

18. Напишите в формулах окисление жирных кислот. Назовите конечные продукты этого процесса и пути их дальнейшего использования.

19. Как рассчитать энергетический выход при окислении жирных кислот до углекислого газа и воды?

20. Назовите ключевые процессы окисления жирных кислот и пути их регуляции.

21. Напишите в формулах окисление глицерина. какова энергетическая ценность этого процесса?

22. Где в клетке локализован синтез жирных кислот? Назовите вещества и ферменты, необходимые для этого процесса?

23. Напишите в формулах синтез жирных кислот.

24. Как регулируется синтез жирных кислот?

25. Назовите источники ацетил-КоА и пути его использования. От чего зависит, каким путем будет использоваться этот метаболит?

26. Напишите в формулах синтез кетоновых тел. Какие функции выполняют кетоновые тела, где они образуются?

27. Приведите схему окисления кетоновых тел до углекислого газа и воды на примере ацетоацетата. Сколько АТФ при этом образуется?

28. Что такое кетоз? Чем он характеризуется? Приведите примеры физиологического и патологического кетоза.

29. Как регулируется синтез кетоновых тел?

30. Напишите в формулах синтез холестерина.

31. В каких тканях синтезируется холестерин? Как регулируется этот процесс? Назовите другие источники холестерина в организме.

32. Какое биологическое значение имеет холестерин?

33. Что такое липопротеины? Приведите их классификацию.

34. Дайте характеристику липопротеинам крови (состав, место образования, функции).

35. Какие липопротеины крови являются атерогенными? Почему ЛПВП считают антиатерогенными?

36. Что такое НЭЖК? Назовите источники НЭЖК и пути их использования.

37. Дайте понятие об атеросклерозе. Назовите биохимические причины факторы риска для развития этого заболевания.

38. Что такое ожирение? Назовите причины ожирения.

39. Что такое липидозы? Какие липидозы вы знаете? Чем они характеризуются?

40. Дайте представление о желчекаменной болезни.

- ситуационные задачи:

1. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) может приводить к нарушению основных функций биологических мембран. Одним из проявлений ПОЛ мембран является нарушение липид-белковых взаимодействий. Как это отразится на функциях белков мембран?

а) объясните, какие компоненты молекул липидов подвергаются этой модификации;

б) какие процессы, протекающие в клетке, могут быть источников активных радикалов, инициирующих ПОЛ;

в) приведите примеры мембранных белков и объясните влияние липидного окружения на их функции.

2. Одной из причин нарушения работы Са²⁺-АТФазы цитоплазматической мембраны является активация ПОЛ мембран. Окислению подвергаются как ацильные остатки ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов, так и НS-группы в активном центре фермента Са²⁺-АТФазы. Как изменится активность Са²⁺-АТФазы в результате ускорения образования активных форм кислорода? Объясните:

а) почему нарушение работы Са²⁺-АТФазы повлияет на концентрацию Са²⁺ в клетке;

б) как изменение электролитного состава клеток влияет на мышечное сокращение, тонус мышечной стенки и артериальное давление.

3. Молекула холестерола легко встраивается в липидный бислой мембран. Существует механизм защиты клеток от избытка холестерола – это реакция его этерификации: образованный продукт не удерживается в мембране. Как изменится содержание холестерола в мембране при снижении активности этого фермента? Напишите схему этерификации холестерола, назовите фермент. Какие изменения в структуре мембран будут наблюдаться при этом нарушении? Как повышение содержания холестерола будет влиять на функционирование белков мембран?

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия (см. контрольные вопросы, тестовые задания и ситуационные задачи занятия №13).

7. Рекомендации по выполнению НИРС, в том числе список тем, предлагаемых кафедрой:

1. Источники активных форм кислорода.

2. Перекисное окисление липидов.

3. Влияние ПОЛ на клетку.

4. Системы защиты клеток от активных форм кислорода.