Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ)

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении динитрофенилгидразонов пирувата, образующегося в результате ферментативной реакции под действием АлАТ. При действии АсАТ образуется оксалоацетат, переходящий в пируват самопроизвольно. Концентрация динитрофенилгидразонов пирувата служит мерой активности обоих ферментов

Ход работы.

1. Определение активности АсАТ. Пробирку с 0, 5 мл буферно-субстратной смеси для АсАТ помещают в термостат при 37^ОС на 5 мин. Затем добавляют 0, 1 мл сыворотки и оставляют в термостате на 30 мин. Когда время инкубации подходит к концу, начинают готовить контроль, в котором 0, 1 мл сыворотки смешивают с 0, 5 мл буферно-субстратной смеси. Сразу же в опытную и контрольную пробы добавляют 0, 5 мл р-ра динитрофенилгидразина и оставляют пробы на 10 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 мл 0, 4Н р-ра едкого натра и через 10 мин колориметрируют пробы при сине-зеленом светофильтре в кювете толщиной 1 см против воды.

2. Определение активности АлАТ. Проводят точно так же, как и определение активности АсАТ, только берут субстратно-буферную смесь для АлАТ.

Расчет активности АсАТ и АлАТ. Разность между оптическими плотностями контрольной и опытной проб указывает изменение оптической плотности в результате прошедшей ферментативной реакции. По этой разности определяют активность АсАТ и АлАТ по калибровочному графику. Активность ферментов выражают в мкмолях пирувата, образовавшегося за час инкубации на 1 мл сыворотки.

Норма активности АлАТ – 0, 1-0, 7 мкмоль/мл за 1 час, АсАТ – 0, 1-0, 5 мкмоль/мл за 1 час.

Диагностическое значение определения активности аминотрансфераз:

Повышение активности аминотрансфераз в сыворотке отмечается при поражении органов и тканей, богатых данными ферментами. При инфаркте миокарда наблюдается повышение активности АсАТ (в 2-20 раз). Увеличение активности начинается через 6-12 часов и возвращается к исходному уровню через 4-5 дней. При стенокардии активность АсАТ, как правило, остается в норме. При заболеваниях печени в первую очередь и наиболее значительно по сравнению с АсАТ изменяется активность АлАТ. При инфекционном гепатите максимум повышения отмечается на 6-10 день заболевания и постепенно возвращается к норме к 15-20 дню. Повышение активности АлАТ отмечается и при безжелтушной форме болезни Боткина. Механические желтухи, холангиты и ряд других заболеваний печени обычно не сопровождаются значительным повышением активности АсАТ и АлАТ и их соотношения (коэффициент де Ритиса). В норме этот коэффициент = 1, 33±0, 42. При паренхиматозных заболеваниях печени происходит снижение коэффициента, а при остром инфаркте миокарда он резко возрастает.

Вопросы к защите лабораторной работы:

1. К каким ферментам (внутри- или внеклеточным) относятся аминотрансферазы?

2. Принцип определения активности аминотрансфераз?

3. При каких заболеваниях увеличивается активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови? Активность каких еще ферментов сыворотки крови увеличивается при этих заболеваниях?

4. Что такое коэффициент де Ритиса?

5. При каких патологиях и как изменяется коэффициент де Ритиса?

5.4. Итоговый контроль знаний:

- вопросы по теме занятия:

1. Напишите реакцию переаминирования аланина, Какой фермент катализирует этот процесс? Какой витамин требуется для работы этого фермента? В какой части клетки локализован данный процесс?

2. Переаминирование аспартата. Какой фермент катализирует эту реакцию?

3. В чем заключается тканевая специфичность ферментов переаминирования?

4. Какое значение в диагностике заболеваний имеют аминотрансферазы?

5. Что такое дезаминирование аминокислот? Какие виды дезаминирования вы знаете?

6. Напишите реакцию дезаминирования глутаминовой кислоты, Какие ферменты и коферменты участвуют в этом процессе?

7. Назовите конечные продукты окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты и пути их дальнейшего использования.

8. Где локализован процесс окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты и какое значение он имеет?

9. Дайте понятие о непрямом дезаминировании аминокислот. Какое значение для организма этот процесс имеет?

10. Восстановительное аминирование аминокислот: ход реакций, ферменты, коферменты, значение для организма.

11. Какие аминокислоты называются гликогенными?

12. Какие аминокислоты называются кетогенными?

- ситуационные задачи:

1. Ребенок двухлетнего возраста поступил в больницу с явлениями отсталости умственного развития. При исследовании мочи выявлено наличие фенилпировиноградной кислоты. Какую пищу должен принимать ребенок и почему?

2. У пациента, перенесшего гепатит, определяли активность АЛТ и АСТ в крови. Активность какого фермента увеличивается в наибольшей степени и почему? При ответе: а) напишите реакции, которые катализируют эти ферменты; б) объясните значение этих реакций в метаболизме аминокислот; в) перечислите основные принципы, лежащие в основе энзимодиагностики.

3. У новорожденного ребенка наблюдается потемнение мочи при контакте с воздухом. Накоплением каких веществ обусловлен этот симптом? Обмен какой аминокислоты нарушен при данном заболевании? Напишите схему соответствующего процесса.

ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ КОНЕЧНОГО УРОВНЯ ЗНАНИЙ

1. ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ РЕАКЦИЯ ПОСТАВЛЯЕТ В ДЫХАТЕЛЬНУЮ ЦЕПЬ

1) аммиак

2) НАДН

3) 2-оксоглутарат

4) ФАДН₂

2. В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ РЕАКЦИЯ ЯВЛЯЕТСЯ

1) дополнительным источником энергии

2) источником глюкозы

3) источником воды

4) источником ацетил-КоА

3. ВИТАМИН В₆ НЕОБХОДИМ ДЛЯ ПРОТЕКАНИЯ

1) фосфорилирования

2) полимеризации

3) декарбоксилирования

4) рацемизации

4. ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ЦИКЛА КРЕБСА

1) является источником 2-оксоглутарата

2) является источником НАДН

3) поставляет ацетил-КоА

4) является источником оксалоацетата

5. ПЕРЕАМИНИРОВАНИЕ – ЭТО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ АМИНОКИСЛОТОЙ И

1) кетокислотой

2) другой аминокислотой

3) жирной кислотой

4) альдокислотой

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия (см. контрольные вопросы, тестовые задания и ситуационные задачи занятия №15).

7. Рекомендации по выполнению НИРС, в том числе список тем, предлагаемых кафедрой:

Подготовить презентацию данной темы. Для презентации рекомендуется использовать учебную и научную литературу, а также материалы сайтов Интернета. Приветствуются авторские разработки в виде схем, анимаций, видеороликов.