Клеточные факторы естественной резистентности

Первые клетки, с которыми взаимодействуют проникшие во внутреннюю среду организма и не инактивированные гуморальными факторами микробы, — это фагоциты (моноциты/макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки). Роль этих клеток в защите организма от инфекций огромна — достаточно сказать, что число инфекций у млекопитающих существенно меньше, по сравнению с численностью микробов в окружающей среде. Это означает, что неограниченному размножению микроорганизмов препятствуют механизмы естественного иммунитета, в значительной степени определяемые активностью фагоцитирующих клеток.

До недавнего времени считалось, что фагоцитоз, как защитная функция врождённого иммунитета, полностью неспецифичен. Основанием для этого служило представление о том, что фагоциты не имеют соответствующих упорядоченных Рц, позволяющих отличать «своё» от «не своего». Фагоцитирование микробов, способность поглощать механические частицы и наличие на макрофагах Рц «для уборки мусора» (Scavenger receptors), связывающих характерные для млекопитающих углеводы погибающих и деградирующих клеток собственного организма, служило дополнительным обоснованием для такого заключения. Однако накоплены данные, которые изменяют существующие представления и показывают, что фагоциты хозяина могут отличать микробы, как «чужое» от «своего», с помощью семейства трансмембранных белков, именуемых Toll-подобными Рц, TLR (от Toll–Like Receptors), в силу своего структурного сходства с Toll–Рц, впервые обнаруженными у дрозофил. Toll–Рц есть у всех многоклеточных — растений и беспозвоночных, определяют их резистентность к заболеваниям, представляя собой древний сигнальный путь защитного назначения.

TLR считают сенсорными структурами фагоцитов, распознающими молекулярную мозаику патогена — PAMP (от Pathogen–Associated Molecular Pattern) и играющими критическую роль в воспалительном и иммунном ответе хозяина [307]. Экспрессия TLR обнаружена на тканевых макрофагах, дендритных и эпителиальных клетках, на Tgd и B–лимфоцитах [304, 566].

К структурам, распознающим молекулярную мозаику патогена — РАМР относят также PRR–Рц (от Pattern Recognition Receptors). PRR–Рц характеризуются сродством к широкому спектру лигандов–патогенов, но не могут отличать патогены друг от друга, экспрессируются на макрофагах, дендритных клетках и NK, видимо также могут присутствовать и на эпителиальных и эндотелиальных клетках кожи, лёгких, ЖКТ. К PRR–Рц относят Рц для маннозы [484].

В семействе TLR–молекул выявлено по меньшей мере 10 различных Рц (TLR1–10), характеризующихся одинаковой молекулярной структурой — наличием внеклеточной части, с часто повторяющимися АК–последовательностями, богатыми лейцином (LRR — от Leucine-Rich Repeat), и цитоплазматическим доменом TIR, гомологичным таковому Рц для интерлейкина–1 (доменTIR — от Toll/Interleukin–1 Receptor homology domain). Гены, контролирующие Рц TLR, локализуются в разных хромосомах: TLR1, TLR2, TLR3 и TLR6 — в хромосоме 4, TLR4 — в хромосоме 9, TLR5 — в хромосоме 1, TLR7 и TLR8 — в хромосоме X, TLR9 — в хромосоме 3. Несмотря на то, что большинство TLR–Рц характеризуется повсеместным распределением, отдельные из них преимущественно определены на разных клетках. Так, TLR1 и TLR9 определяются преимущественно на лейкоцитах, TLR7 — на клетках селезёнки и плаценты, TLR5 — на лейкоцитах и клетках простаты, TLR10 — на клетках лимфоидных тканей, TLR8 — на лейкоцитах и клетках лёгких, TLR3 — на дендритных клетках, TLR2 и TLR4 — на дендритных клетках моноцитарного происхождения, TLR9 — на плазмацитоидных дендритных клетках, a TLR2, 3 и 6, но не TLR4 и 9 — на клетках эпителия верхних дыхательных путей. Последние экспрессируют также молекулыCD14 и MyD88 [304, 307]. TLR4 обнаружен и на периферических T– и B–лимфоцитах детей (2–12 лет) и взрослых (старше 18 лет), его экспрессия усиливалась под влиянием ЛПС — у детей на клетках фенотипа CD19/TLR4, у взрослых — на клетках фенотипа CD4^–, но не CD4⁺ [566].

Как и PRR–Рц, TLR–Рц характеризуются широким спектром специфичности к различным лигандам микробов, однако каждый из этих Рц по-видимому ограничен определённым спектром. Так, например, лигандом для Рц TLR2 являются липопротеины, пептидогликан и липопептиды грамположительных бактерий, липопротеины микоплазмы, липопептиды микобактерий, включая активирующий макрофаги липопротеин–2; для Рц TLR5 — флагеллин жгутиковых бактерий; для Рц TLR9 — бактериальная ДНК с неметилированным нуклеозидом CpG (отCytidine-phosphate-Guanosine), например, микобактерий. Отдельные лиганды могут связываться несколькими Рц. Так, липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий могут связываться какTLR2, так и TLR4, двунитевую РНК вирусов могут распознавать как TLR3, так и TLR7. Некоторые РАМР-структуры распознаются при взаимодействии нескольких TLR–Рц, например TLR1, TLR2TLR6 и неидентифицированным TLR–Рц TLRX. Для отдельных рецепторных структур, например для белка, связывающего ЛПС — ЛПС–СБ, характерна каскадность действия, обеспечивающая проведение сигнала в клетку (глава 7. «Возбуждение и торможение иммунной системы»).

Среди других рецепторных структур фагоцитов, определяющих их роль в естественной резистентности к инфекциям, следует назвать интегрины и Рц для маннозы.

Интегрины a_Mb₂ (Рц CR3 или интегрин CD11b/CD18) и a_Xb₂ (Рц CR4 или интегрин CD11c/CD18) фагцитов распознают и связывают частицы, опсонизированные компонентом комплемента C3bi или фибронектином, способствуют их эффективному поглощению и перевариванию. Вместе с тем, интегрины имеют химическое сродство и способны связывать ряд бактериальных продуктов — липополисахариды, липофосфогликан лейшманий, гемагглютинин филаментов бордетелл, поверхностные структуры дрожжевых клеток кандида и гистоплазмы. Как было показано выше, интегринa_Xb₂ экспрессируют тканевые макрофаги и дендритные клетки, тогда как интегрин a_Mb₂ обнаруживают на моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, гранулоцитах и дендритных клетках, а также на NK [568]. Интегрины играют важную роль не только в защитных реакциях врождённого иммунитета, но и в процессах межклеточных взаимодействий, обеспечивающих реализацию реакций иммунной системы.

Особенности их действия, также как и других факторов межклеточного взаимодействия, обобщены в монографии [39].

Рц для маннозы MR (от mannose receptor) относится к семейству полилектиновых Рц, включающего помимо Рц для маннозы три компонента — Рц PLA₂ для секреторной фосфолипазы А2, Рц Endo180 для активатора плазминогена типа урокиназы (распознаёт N–ацетилглюкозамин) и DEC–205, который участвует в поглощении Аг для его переработки и представления дендритным клеткам.

MR–Рц — это лектин C–типа, включающий 5 доменов — N–терминальный CR–домен (от Cysteine Rich domain), домен FNII (от FibroNectin type II–like repeat), домен CRD (от CarbohydrateRecognition Domain), трансмембранный домен и C–терминальный цитоплазматический домен. Последний локализуется в везикулах, покрытых клатрином и может подвергаться эндоцитозу (рис. 3). Для всех лектинов, включая семейства коллектинов и полилектинов, в том числе Рц для маннозы, связывающий маннозу лектин и сурфактанты SP–A и SP–D, характерной является структурная гомология домена CRD, обеспечивающего связывание несущей его структуры с лигандами микробов. Лигандами для MR–Рц являются углеводные структуры бактерий (Mycobacteriumtuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), вирусов (гриппа, ВИЧ), простейших (Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi), грибков (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Pneumocystis carinii). Связывание Рц с лигандом сопровождается быстрым фагоцитозом микроба по типу «застежки молнии», завершающимся при 37 °C за 5 мин, и формированием внутриклеточного сигнала, приводящего к активации клеток организма. Зарегистрирована многократная реэкспрессия активно связывающего соответствующие лиганды Рц на мембране (t_1/2 30 час.), не нарушаемая ингибитором белкового синтеза — циклогексимидом. В макрофагах поглощённые лиганды доставляются к лизосомам в течение 20 мин. Показано также наличие растворимой формы Рц, активной в отношении связывания лиганда. Экспрессия MR–Рц кодируется отдельным геном, локализующимся на коротком плече хромосомы 10, регулируется цитокинами — интерфероном–g, интерлейкинами–4, –10, –13 [484]. Одни из них усиливают экспрессию MR–Рц и функции макрофагов (интерлейкины–4 и –13), другие, например продуцируемый T–хелперами второго порядка (Th2) интерлейкин–10, наоборот, их подавляют. Продукт T–хелперов первого порядка (Тh1) — интерферон–g подавляет экспрессию MR–Рц на макрофагах, но усиливает фагоцитарную активность макрофагов при инфицировании, например кандидами.

Рис. 3. Фагоцитоз и эндоцитоз с участием рецептора для маннозы MR (от mannose receptor): 1. N–терминальный домен CR (от — Cysteine Rich domain); 2. Домен FNII (от — FibroNectin type II–likerepeat); 3. Домен CRD (от — Carbohydrate Recognition Domain); 4. Трансмембранный домен; 5. Цитоплазматический домен; 6. Микроб. Пояснения в тексте.

MR–Рц относят к маркёрам макрофагов, экспрессируемым с высокой плотностью на воспалительных клетках и с малой плотностью — на активированных. Среди макрофагоподобных клеток MR–Рц обнаруживаются на дендритных клетках, остеокластах, астроцитах, клетках микроглии, мезангиальных клетках почки, купферовских клетках, эндотелиальных клетках печени, на клетках пигментного эпителия сетчатки [484].

В целом, распознавая и связывая микробы, фагоциты их поглощают и убивают, активируются и синтезируют растворимые молекулы — цитокины. Опсонизированные микробы значительно интенсивнее захватываются и убиваются фагоцитарными клетками, по сравнению с неопсонизированными. Этот тип элиминации возбудителя эффективен только в отношении внеклеточных условно–патогенных бактерий со слабой вирулентностью.

Затем, как правило, вступает второй, более мощный эшелон защиты организма от инфекции — ранний индуцибельный ответ, действие которого длится в течение 96 часов, пока не начнут работать факторы специфического иммунитета. В нем также можно выделить клеточные и гуморальные факторы. К первым относят активированные макрофаги, нейтрофилы и NK; ко вторым — цитокины и белки острой фазы, продуцируемые клетками печени под влиянием этих цитокинов. Тканевые макрофаги, активированные бактериальными Аг в процессе фагоцитоза возбудителя, вырабатывают ряд цитокинов (монокинов) — TNFa, ИЛ–1b, ИЛ–6, ИЛ–8, ИЛ–12, ИФНa, ГМ–КСФ и др., которые оказывают активирующее воздействие на новые популяции клеток, мигрирующих в воспалительный очаг — моноциты, нейтрофилы, NK. Эти клеточные популяции также начинают продуцировать цитокины, вовлекая в процесс защиты все новые и новые клетки. Кроме того, в процессе разрушения микроба образуются микробные пептиды, которые макрофаг в комплексе с Аг главного комплекса гистосовместимости класса II представляет T–лимфоцитам. Это важнейший этап, без которого невозможно развитие специфического иммунитета.

Действие цитокинов, продуцируемых макрофагами в течение раннего индуцибельного ответа, определяет основные механизмы антиинфекционной защиты на первых этапах развития инфекционного процесса. Важнейшим цитокином, продуцируемым активированными макрофагами в течение раннего индуцибельного ответа, является ИЛ–12. Следует отметить, что от этого цитокина зависит характер иммунного ответа: преимущественное развитие реакций клеточного или гуморального типов. ИЛ–12 активирует моноциты/макрофаги, нейтрофилы и NK. Активированные таким путём фагоциты более интенсивно поглощают микробы, быстрее их убивают и переваривают. Активированные NK приобретают большую цитотоксическую активность по отношению к клеткам, инфицированным возбудителем.

ИЛ–1, ИЛ–6, TNF, ИЛ–8, ГМ–КСФ и другие цитокины, продуцируемые макрофагами в течение раннего индуцибельного ответа, являются провоспалительными цитокинами. Их действие полностью определяет развитие воспалительного процесса, развивающегося при внедрении микроба в макроорганизм. Приведём конкретные примеры их участия в развитии воспаления:

· Повышение температуры при инфекционных процессах зависит от действия на ЦНС ИЛ–1 и ИЛ–6.

· Синтез белков острой фазы: C–реактивного белка, связывающего маннозу лектина (СМЛ) и др., зависит от действия на клетки печени ИЛ–1 и ИЛ–6. Белки острой фазы обладают выраженной способностью опсонизировать внедрившиеся в организм микробы.

· Развитие классических признаков воспаления: опухоль, покраснение, боль, жар, полностью зависит от действия TNF.

· Лейкоцитоз в периферической крови, как характерная черта воспаления, зависит от ГМ–КСФ, Г–КСФ, М–КСФ, усиливающих пролиферацию и дифференцировку клеток–предшественниц костного мозга и ускоряющих их созревание до зрелых гранулоцитов с 7 до 1, 5 дней.

· Миграция нейтрофилов и моноцитов в очаг воспаления зависит от a– (ИЛ–8) и b–хемокинов, а также ГМ–КСФ, являющихся мощными индукторами движения фагоцитов.

В воспалительном очаге наряду с тканевыми макрофагами — главными инициаторами воспаления, существенное значение в борьбе с инфекцией приобретают и другие клеточные элементы. Это прежде всего нейтрофилы и NK.

Важными защитниками организма от внеклеточных бактерий на стадии раннего индуцибельного ответа являются нейтрофилы. Они составляют большую часть лейкоцитов крови (60–70%), в норме не мигрируют в периферические ткани. Однако, они первые участники воспалительного процесса, при воспалении характеризуются наличием двух важных функций. Во-первых, они поглощают и убивают бактерии. Этот процесс резко усиливается при опсонизации возбудителей и при активации нейтрофилов цитокинами, вырабатываемыми макрофагами и NK. Во-вторых, они сами являются мощными продуцентами цитокинов: ИЛ–1b, ИЛ–8, ИЛ–12, TNFa, ГМ–КСФ, ИФН a, фактора активирующего тромбоциты, фактора роста фибробластов, с помощью которых активируются и вовлекаются в борьбу с возбудителем новые эшелоны клеток, прибывших в очаг воспаления.

В противомикробной активности нейтрофилов существенная роль принадлежит пептидам–антибиотикам — a–дефензинам (HNP–1, –2, –3 и –4), первоначально названным лизосомными катионными белками. a–Дефензины являются основным компонентом азурофильных гранул нейтрофилов, содержащих миелопероксидазу. Будучи положительно заряженными, они связываются и проникают в отрицательно заряженную стенку и фосфолипидную мембрану микробов, образуют поры в микробах и нарушают синтез их ДНК, РНК и белка. Микробицидное действие a–дефензинов распространяется на многие грамотрицательные и грамположительные бактерии, дрожжевые грибы, отдельные оболочечные вирусы. Экспрессия a–дефензинов зарегистрирована также в отдельных популяциях T–лимфоцитов человека и в NK. Сходной активностью характеризуются b–дефензины (HBD–1, –2, –3), отличающиеся от a–дефензинов положением и связью цистеинов. Однако в отличие от a–дефензинов, они экспрессируются в эпителиальных клетках мочеполового тракта, почек и в некоторых железах. Так, экспрессия HBD–1 зарегистрирована в клетках слюнных желёз, трахеи, простаты, плаценты. Синтез HBD–2 индуцируется в кератиноцитах кожи, хотя эти молекулы не являются конституциональными для этих клеток.

Из других 10 известных пептидов–антибиотиков, именуемых кателицидинами и выявляемых в нейтрофилах крупного рогатого скота, свиней, овец и коз, один (hCAP–18/LL–37) обнаружен у человека. Следует отметить, что пептиды–антибиотики могут не только опосредовать антимикробную резистентность, но и содействовать позднему развитию гуморального и клеточного иммунитета.

Главными защитниками организма от разного рода инфекций на стадии раннего индуцибельного ответа являются NK. Эти клетки относятся к категории основных эффекторов естественного или врождённого иммунитета, играющих важнейшую роль в обеспечении естественной резистентности организма к различным возбудителям инфекций — бактериальных (грамположительных, грамотрицательных, внутриклеточных) и протозойных, в противовирусном и в противоопухолевом иммунитете. NK не экспрессируют антигенраспознающих Рц типа TCR или BCR, непосредственно лизируют клетки–мишени без предварительной активации и без ограничений со стороны главного комплекса гистосовместимости, проявляют антителозависимую клеточную цитотоксичность, помимо активирующих, несут на поверхности Рц ингибирующего типа, лигандами для которых являются Аг гистосовместимости класса I — HLA–A, –В, –С, –Е, –G. При этом активность и аффинность ингибирующих Рц превалирует над таковыми активирующих структур. В связи с постоянным прессингом молекул MHC класса I, нормальным физиологическим состоянием NK является их неактивированная форма. Однако при отсутствии на клеточной мембране Аг MHC класса I или при снижении их экспрессии, например, вследствие инфицирования или опухолевой трансформации клеток, NK активируются, распознают клетки, не несущие на мембране «своего», как чужеродные и уничтожают их.

Лизис мишеней происходит в результате высвобождения NK пре–формированных цитоплазматических гранул, содержащих перфорин и гранзимы. В плазматической мембране клеток–мишеней белок (перфорин) полимеризуется и образует поры, через которые в клетку проникают индуцирующие апоптоз сериновые эстеразы — гранзимы. Этот эффект получил название гранулярного экзоцитоза. Гранзимы могут проникать в клетки–мишени и через Рц для маннозо–6–фосфата, а их разрушение может также индуцироваться через механизм, компонентами которого являются молекулы Fas и TRAIL.

Важность NK в защите организма от внутриклеточных микробов демонстрируется следующим опытом: мутантные мыши, не содержащие T– и B–лимфоцитов, но имеющие NK не чувствительны к инфекции, вызванной листериями (Listeria monocytogenes). Однако мутантные мыши, не содержащие NK, но нормальные по T– и B–лимфоцитам, погибают от этой инфекции в течение 2–3 дней после заражения.

Активность NK по отношению к инфицированным клеткам может быть многократно усилена под влиянием ИЛ–12 и ИФНa, продуцируемых моноцитами/макрофагами, и ИФНb, вырабатываемого фибробластами. Кроме того, ИЛ–12 совместно с TNF обладает способностью индуцировать синтез NK ИФНg, также обладающего выраженной способностью активировать нейтрофилы, моноциты/макрофаги и новые NK. Таким образом, задолго до включения в процесс защиты Аг–специфических T–лимфоцитов, главных продуцентов ИФНg, NK начинают вырабатывать эти важные для защиты организма от внутриклеточных возбудителей молекулярные продукты. NK обладают также способностью продуцировать ИФНa, ИФНg, ГМ–КСФ, ИЛ–3, ИЛ–8 и другие хемокины.

Как уже отмечалось, факторы естественной резистентности и раннего индуцибельного ответа осуществляют защиту организма в течение первых 96 часов после инфицирования. Примерно в эти сроки начинает развиваться приобрётенный или адаптивный иммунный ответ, то есть собственно специфический иммунитет, представляющий заключительный и наиболее мощный эшелон защиты организма.

Далее будут рассмотрены структура и принципы физиологической реакции организма в виде функционирования специфического звена иммунной защиты, обеспечиваемого лимфоцитами.

· Глава 2
Структура и функции иммунной системы