Стволовые клетки и закономерности их рециркуляции

С начала 20–го века, когда A.A. Максимовым было выдвинуто положение о полипотентности стволовых кроветворных клеток (СКК) [390] и вплоть до настоящего времени проблеме изучения функций стволовых клеток и их регуляции уделяется самое пристальное внимание.

По общепринятой терминологии, стволовые клетки — это родоначальные клетки–предшественницы, способные к самоподдержанию и к дифференцировке в множественные типы клеток. Стволовые клетки разделяют на две основные категории. Одни из них способны дифференцироваться во все типы клеток тела, их относят к категории плюрипотентных, в качестве примеров таких клеток рассматриваются эмбриональные стволовые клетки и эмбриональные зародышевые клетки. Другая категория стволовых клеток — мультипотентные. Стволовые клетки этого типа могут быть выделены из разных тканей животных, включая ткани плода, в процессе онтогенеза и характеризуются как линейноспецифические, подразделяются на стволовые кроветворные (гемопоэтические) клетки, печёночные стволовые клетки, стволовые клетки поджелудочной железы, нейронные стволовые клетки, и т.д. СКК через промежуточные формы олигопотентных предшественников для лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки дают начало клеткам–предшественницам, дифференцирующимся в отдельные линии клеток — T–лимфоциты, B–лимфоциты, NK, эритроциты, макрофаги, гранулоциты, мегакариоциты [90, 332].

Основные параметры СКК были охарактеризованы в 60–80-х годах прошлого столетия. Была выявлена и изучена миграционная активность СКК и их способность к рециркуляции [65], доказана способность этих клеток дифференцироваться в различные ростки систем кроветворения и иммунитета, изучено регуляторное действие на функции СКК гемопоэтического индуктивного микроокружения [61, 64, 91] и центральных элементов различных отделов системы иммунитета — макрофагов [20] и лимфоидных клеток, включая сиcтемы T– [45, 468, 471] и B–лимфоцитов [32, 33, 382], установлена независимость гемопоэтических клеток–предшественниц от стромальных стволовых клеток, был разработан ряд модельных систем для культивирования СКК, начато изучение поверхностных структур стволовых клеток, в частности маркёрных.

Новый взрыв интереса к стволовым клеткам особенно сильно проявился в последние годы в связи с развитием исследований по актуальным проблемам гематологии и трансфузиологии [9] и накапливающимися данными о линейной и нелинейной пластичности СКК, проявляющейся в нестабильности их дифференцировки и способности СКК участвовать в образовании других отдельных тканей организма. Это определило ряд важных задач, среди которых центральной является поиск возможностей регуляции их функций в контролируемых условиях культивирования с целью получения «запасных частей» в виде специализированных клеточных систем для «ремонта» нарушенных функций различных тканей и органов или для замены клеток полноценно функционирующими клеточными элементами. Решение этих задач открывает огромные перспективы в предупреждении и лечении многих тяжёлых и зачастую неизлечимых болезней — рассеянный склероз, паркинсонизм, мышечная дистрофия, инсульт, инфаркт, диабет, и многие другие. Считается, что принципиальное решение таких задач возможно. В качестве одного из аргументов их положительного решения могут рассматриваться многочисленные примеры дифференцировки клеток негемопоэтических тканей, в частности клеток скелетных мышц и нервной ткани, в клетки крови или дифференцировки СКК в другие линии клеток, такие как клетки печени [123, 349], нервной ткани [398, 399], скелетной [159, 230] и сердечной [290, 445] мышцы и др., выявления клеток донорского происхождения в негемопоэтических тканях (скелетные мышцы и мышцы сердца, печень, кость, астроглия головного мозга, эндотелий сосудов и эндотелий в регионе инфаркта, и др.) в результате трансплантации костномозговых клеток. Эти исследования рассмотрены в публикациях [7, 225, 332 и др.]. В то же время, имеется целый ряд работ, не получивших доказательств нелинейной пластичности СКК. В связи с этим представляет существенный интерес точка зрения М. Kucia et al. [344] на проблему трансдифференцировки СКК. Авторы полагают, что в костном мозгу предсуществуют тканеспецифические стволовые клетки, а в периферической крови циркулируют тканекоммитированные клетки–предшественницы, которые конкурируют за тканеспецифические ниши и заселяют их. Циркуляция таких клеток в крови играет важную физиологическую роль, поддерживая пул стволовых клеток в отдельных частях организма в количествах, достаточных для их заселения в экстреных ситуациях. Количество таких клеток в крови может быть увеличено с помощью методов, обеспечивающих выселение стволовых клеток из костного мозга. Вместе с тем, костномозговая ткань является источником хемоаттрактантов не только для стволовых клеток, но и для уже дифференцированных тканеспецифических клеток–предшественниц, циркулирующих в периферической крови, являясь для них «домом» или «местом укрытия». В пользу представленной ими концепции, авторы приводят даные по выявлению мРНК для ряда ранних маркёров мышечных (Myf–5, Myo-D), невральных (GFAP, нестин) и печёночных клеток (СК19, фетопротеин) в циркулирующих в периферической крови мононуклеарах, лишенных прилипающих клеток. Более того, уровни этих маркёров в периферической крови возрастают после введений Г–КСФ, применяемых для выселения клеток–предшественниц из костного мозга. В костном мозгу человека и мышей обнаружены тканеспецифические стволовые клетки, экспрессирующие Рц СХС4 и обогащаемые после хемотаксиса в градиенте SDF–1.

В свете отмеченных выше задач представляют существенную значимость изученные параметры функциональных свойств СКК, в частности их способность к миграции и рециркуляции, обеспечивающих поддержание физиологического гомеостаза млекопитающих в процессе онтогенеза [75]. Не менее значимыми являются также накопленные сведения о системах оргаизма, контролирующих отдельные свойства СКК, относимые к центральным — их миграционную активность, способность к пролиферации, дифференцировочные потенции.

СКК постоянно мигрируют из костного мозга в кровоток, поступают в тимус и другие лимфоидные органы, в которых происходит их лимфопоэтическая дифференцировка, сопровождаемая размножением и накоплением T– или B–лимфоцитов. Иначе говоря, СКК костного мозга являются своего рода «семенным материалом» для всех лимфоидных тканей и органов, поэтому костный мозг считается одним из центральных органов иммунной системы (глава 2, рис. 4, 5). Нами ещё в начале 70-х годов [66] в опытах на различающихся по хромосомным маркёрам Т6Т6 сингенных (совместимых по комплексу Н–2) мышах, соединенных в парабиоз (целиарный анастомоз), было показано, что стволовые клетки костного мозга заселяют через циркуляцию в периферической крови как кроветворные, так и лимфоидные ткани (рис. 15).

Рис. 15. Опыты по изучению происхождения потомков стволовых клеток, мигрирующих из костного мозга (на модели парабиоза) (схема). Пояснения в тексте.

В эмбриональном периоде концентрация циркулирующих стволовых клеток в крови в несколько раз выше, чем у взрослых, и достигает максимального уровня в конце фетального и раннего неонатального периода жизни [67]. В процессе раннего онтогенеза стволовые клетки гемангиобласта (общий предшественник эндотелиальных и гемопоэтических клеток; [552а]) мигрируют в островки васкулярной ткани желточного мешка. Как известно, желточный мешок — основное место эмбрионального эритропоэза, в нем образуются примитивные эритроидные клетки, завершающие созревание в кровяном русле. Однако, как оказалось, помимо эритроидных предшественников, в желточном мешке образуются также миелоидные и мультипотентные предшественники [452]. Из желточного мешка стволовые клетки мигрируют в эмбриональную печень и далее — уже как потомство «переселившихся» стволовых клеток — из печени в селёзенку. Позднее мигрирующие из печени и селезёнки стволовые клетки заселяют костный мозг, который становится ведущим органом гемопоэза и иммуногенеза. В дальнейшем у взрослых костный мозг сам «экспортирует» стволовые клетки.

Следует отметить, что стволовые клетки, заселяющие различные гемопоэтические ткани на ранних этапах онтогенеза, характеризуются разными свойствами, определяемыми по-видимому потребностью в транскрипционных и секретируемых факторах, экспрессией молекул адгезии, рецепторных и иных маркёрных структур, эффективностью взаимодействия с элементами микроокружения, и др. Так, клетки фенотипа CD4⁺CD3^– (экспрессируют молекулы интегрина a₄b₇ и лимфотоксина b), дающие начало дендритным АПК, NK и фолликулярным дендритным клеткам, но не T– и B–лимфоцитам, формируются только в тканях плода. Эти же клетки участвуют в органогенезе лимфатических узлов [396]. СКК фетальной печени и костного мозга, но не желточного мешка, активно приживаются в организме взрослых летально облученных животных, причём СКК фетальной печени восстанавливают летально облученных половозрелых животных более эффективно, по сравнению с СКК костного мозга [332]. В последние годы выявлен ряд факторов, влияющих на выбор клеткой пути дифференцировки или самоподдержания. Среди них — активность теломеразы, такие факторы, как НОХВ4, Notch, Wnt, отдельные цитокины. Однако в целом, сигнальные пути, определяющие судьбу стволовой клетки (терминальная дифференцировка, самоподдержание, апоптоз) изучены мало или не изучены.

Процессы миграции СКК, как хоминга, так и их выселения из костного мозга, в значительной степени определяются экспрессией на эндотелиальных клетках и на СКК молекул адгезии и хемотаксиса — Е- и/или P–селектина, молекулы 1 адгезии сосудистых клеток VCAM–1 (от — Vascular Cell Adhesion Molecule–1), интегрина b₁молекул очень поздней адгезии (Very-Late-Adhesionmolecule b₁ integrin) VLA–2 (a₂b₁) VLA–4 (a₄b₁), VLA–5 (a₅b₁), хемокинового Рц CXCR4, молекул SDF–1a, LFA–1, и др. Примером значимости таких молекул может служить исследование функциональной активности СКК, дефицитных по экспрессии интегрина b₁ [477]. Было показано, что такие клетки характеризуются гематолимфоцитарным дифференцировочным потенциалом in vitro и в эмбриональных органных культурах, однако они не способны заселять гемопоэтические ткани взрослых животных или летально облученных реципиентов. Отмечена также их сниженная адгезия к клеткам эндотелия и подавленная способность к рециркуляции.

Способность СКК к миграции сохраняется на протяжении всей жизни. Однако, несмотря на интенсивное изучение проявления и контроля основных эффектов миграционной активности СКК в процессе онтогенеза — их мобилизации (миграция из костного мозга в периферическую кровь) и хоминга (миграция из периферической крови в костный мозг), физиологическая значимость этих явлений в жизни нормальных половозрелых животных остаётся неустановленной. Так, например, рассматривается возможность того, что миграция СКК —фундаментальная стадия в развитии этих клеток, необходимая для решения вопроса о судьбе СКК (дифференцировка) через релокализацию дочерних СКК в отдельных костномозговых нишах. Другая точка зрения предполагает, что миграционная активность СКК, жизненно важная при формировании гемопоэтических органов, может представлять собой во взрослой жизни остаточное, до некоторой степени ненужное, явление. Иная, диаметрально противоположная точка зрения рассматривает СКК в качестве быстро рекрутируемого источника клеток–предшественниц, способных инициировать экстрамедуллярное кроветворение в случае катастрофической потери крови или обеспечивать регенерацию хронически повреждаемых негемопоэтических тканей. Процесс миграции СКК может обеспечивать и нормализацию участков костного мозга, утративших кондиционность вследствие тех или иных воздействий. Действительно, в организме позвоночных кроветворные ткани, содержащие стволовые клетки, располагаются отдельными очагами (в костях скелета и селёзенке), связь между которыми поддерживается через систему кровообращения. Система чётко реагирует как единый орган при локальных поражениях или при экстремальных состояниях, вызывающих повышенный запрос в кроветворении или иммунопоэзе. Какие механизмы участвуют в интеграции системы стволовых клеток? Оказалось, что функционирование кроветворной ткани как физиологически единой системы осуществляется в значительной степени благодаря способности стволовых клеток к рециркуляции и обмену между различными участками кроветворной системы.

Определение поверхностного фенотипа СКК — один из важнейших способов идентификации этих клеток. Для получения СКК человека применяют методы осаждения (центрифугирования) в градиенте плотности, элютриации, афереза, проточной цитометрии. Методы выделения стволовых клеток неодинаковы для разных лиц, выбор зависит от состояния донора, целей и задач выполнения такой процедуры. Так, в среднем, одна процедура непрерывно-проточного афереза обеспечивает получение клеток фенотипа CD34 из периферической крови в 3, 7 раза больше, по сравнению с обычно используемой процедурой выделения таких клеток из костного мозга. Однако при выделении СКК из периферической крови возможны осложнения в виде пневмоторакса, цитопении, лейкопении, лимфопении, тромбо-цитопении [200]. Для обогащения периферической крови СКК применяют системные назначения разных препаратов, в том числе отдельных цитостатиков — 5-фторурацила, циклофосфамида, оксимочевины и/или цитокинов, таких как Г–КСФ, ГМ–КСФ, ИЛ–3, ИЛ–8, ИЛ–11, SIF и др. Показано, по крайней мере у мышей, что выселение СКК из костного мозга находится под генетическим контролем. Локусы, контролирующие выселение СКК из костного мозга под влиянием Г–КСФ и играющие роль регуляторов мобилизации гемопоэтиеских клеток–предшественниц, картированы в хромосомах 2 и 11 мышей [249]. Как и в процессе хоминга, в процессе мобилизации СКК важную роль играют молекулы VCAM–1. Так, например, показано, что после внутривенного введения мышам АТ к VCAM–1 число колониеобразующих клеток (CFC, от — Colony–Forming Cells) увеличилось в крови в 11, 4 раза, а число CFU-S (от —Colony–Forming Unit Spleen) — в 21, 6 раза. При этом количество таких предшественников падало в костном мозгу, увеличивалось в селёзенке, но не изменялось в указанных тканях после введения АТ к молекуле VLA–4. В случае совместного введения рекомбинантного Г–КСФ и АТ к VCAM–1 число CFC в крови увеличилось в 141, 8 раза, число CFU-S — в 439 раз.

Для сохранения выделенных СКК используют методы криоконсервирования.

Основной структурой, маркирующей СКК человека, является сиаломуцин CD34 [332, 338], лиганд для L–селектина. Его экспрессируют около 0, 1% СКК периферической крови взрослых и детей и клетки эндотелия малых сосудов. Аг CD34 также экспрессируют 0, 5–5% клеток фетальной печени, пуповинной крови и костного мозга, однако быстро утрачивают его в процессе клеточной дифференцировки. Клетки фенотипа CD34⁺ характеризуются достаточно высокой степенью гетерогенности. Большинство CD34⁺–клеток (90–99%) несет на мембране Аг CD38 и линейные клеточные маркёры (фенотип CD34⁺CD38⁺Lin⁺), характерные для клеток–предшественниц с линейно-ограниченной степенью дифференцировки. И только 1–10% клеток фенотипа CD34⁺ не экспрессируют Аг CD38 и линейные маркёры клеток, включающие Аг CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD56, CD11b, CD14, CD15 (фенотип CD34⁺CD38^–Lin^–). Считают, что клетки фенотипаCD34⁺⁺CD38^–Lin^– являются предшественниками клеток фенотипа CD34⁺⁺CD38⁺Lin^– [423], а клетки фенотипа CD34^– являются предшественниками клеток фенотипа CD34⁺ [114].

Как оказалось, клетки фенотипа CD34⁺Lin^– также не гомогенны и могут быть подразделены по экспрессии Аг Thy–1. Показано, что СКК фенотипа CD34⁺Lin^–Thy–1⁺, но не CD34⁺Lin^–Thy–1^–, формируют предшественники B–лимфоцитов и клеток миелоидного ряда, тогда как предшественники T–лимфоцитов образуются главным образом из клеток фенотипа CD34⁺Lin^–Thy–1^– и, возможно, из весьма небольшого количества клеток фенотипа CD34⁺Lin^–Thy–1⁺. При этом оказалось, что фактически все клетки фенотипа CD34⁺Lin^–Thy–1⁺ выявлялись во фракции клеток, не экспрессирующих на поверхности Аг CD38. Показано также, что клетки фенотипа CD34⁺CD38^–Lin^–Thy–1⁺ определяют инициацию длительного культивирования клеток в культуре и образование миелоидных колоний [200, 332]. Для контроля обогащения клеточной взвеси СКК используют также краситель Hoecht 33342, а длина теломера (концевого участка хромосомы) коррелирует с пролиферативным потенциалом субпопуляций СКК — длиннее у клеток фенотипа CD34⁺CD38^–, по сравнению с клетками фенотипа CD34⁺CD38⁺ одного и того же донора [576].

В отличие от человека, СКК мышей Аг CD34 не экспрессируют или экспрессия этого Аг низкая, фенотип СКК мышей определяют как Lin^–/1oc–Kit⁺Sca–1⁺, а отдельные представители субпопуляции СКК фенотипа Lin^–c–Kit⁺Sca–1⁺Thy1.1^lo при пересадке мышам могут характеризоваться мультилинейной дифференцировкой и способностью к самоподдержанию.

Другим Аг, маркирующим СКК человека, является гликопротеин АС133 (CD133) [5, 608]. Была обнаружена особенность его экспрессии, заключающаяся в том, что он выявлялся не только на СКК фенотипа CD34⁺Lin^–, но и на клетках, не экспрессирующих Аг CD34 (фенотип CD34^–Lin^–) и рассматриваемых в качестве предшественников клеток фенотипа CD34⁺Lin^–. В связи с возможностью такого двойного мечения, Аг АС133 отдают предпочтение в качестве маркёра СКК, по сравнению с Аг CD34 [332, 608]. Способность АС133 маркировать ранние клетки–предшественницы была продемонстрирована и при фракционировании клеток фенотипа CD34^–CD38^–Lin^– из пуповинной крови человека по способности экспрессировать Аг АС133 и CD7. Оказалось, что подавляющее большинство клеток этой популяции характеризовалось фенотипом CD34^–CD38^–Lin^–AC133^–CD7⁺ и только 0, 2% клеток имело фенотип CD34^–CD38^–Lin^–AC133⁺CD7^–, то есть в количестве, эквивалентном тому, которым характеризуется выделение предшественников фенотипа CD34. Эти клетки выявлялись в костном мозгу мышей NOD–SCID через 8 недель после трансплантации предшественников фенотипа AC133⁺CD7^–, выделенных из популяции клеток фенотипа CD34^–CD38^–Lin^–, проявляли клоногенную активность и способность дифференцироваться в клетки фенотипаCD34⁺ [245]. Однако в других исследованиях этот эффект не подтвердился. Было показано, что среднее число СКК фенотипа CD34 периферической крови человека, несущих Аг АС133, составляет 75, 8 (49, 9–95, 2)%, все эти клетки имели фенотип CD34⁺AC133⁺. В проведённом исследовании периферические СКК фенотипа CD34^–AC133⁺ не обнаружены. В связи с этим заключено, что Аг АС133 не может быть альтернативой Аг CD34 [5].

При анализе экспрессии на СКК человека Аг CD45 было показано, что его уровни нарастают по мере дифференцировки клеток, тогда как уровни экспрессии Аг CD34 — падают [5]. По мере дифференцировки клеток–предшественниц зарегистрировано также снижение экспрессии Аг АС133 [379].

В рассмотренных примерах преимущественно представлены Аг, маркирующие СКК человека, которые способны дифференцироваться как в сторону лимфо–, так и миелопоэза. Не менее значимым является определение фенотипа СКК, дающих потомство только предшественников лимфопоэза или только предшественников миелопоэза. В качестве кандидатных молекул, позволяющих различать СКК, дифференцирующиеся в этих направлениях, рядом авторов рассматриваются Аг CD7 и CD10, Рц для ИЛ–7 (ИЛ–7Ra) и терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза [269, 332, 403]. Так, например, установлено, что клетки фенотипа Lin^–CD34⁺CD38⁺CD10⁺ костного мозга плода и взрослых лиц содержат клональные предшественники дендритных клеток, NK, T– и B–лимфоцитов и не содержат клеток–предшественниц миелопоэтической дифференцировки. Эта клеточная популяция содержит также клетки, экспрессирующие молекулы ИЛ–7Ra. Предшественниками клеток фенотипа Lin^–CD34⁺CD38⁺CD10⁺ являются, по-видимому, клетки фенотипа Lin^–CD34⁺CD38^–CD7⁺. Фракционирование СКК фенотипа Lin^–CD34⁺CD38⁺CD10⁺ наCD10^loIL–7Ra⁺ и на CD10⁺ИЛ–7Ra^––клетки установило, что фракция клеток фенотипа CD10^loIL–7Ra⁺ высоко обогащена клональными предшественниками B–лимфоцитов. При идентификации СКК человека, дифференцирующихся в направлении миело-, но не лимфопоэза, было показано, что такие клетки выявляются во фракции клеток фенотипа CD34⁺CD38⁺, не содержащих линейноспецифических маркёров CD7, CD10, ИЛ–7Ra. Дальнейшее фракционирование СКК по экспрессии изоформы Аг CD45 (CD45RA) и Рц для ИЛ–3 (ИЛ–3Ra) дало возможность установить отличия в фенотипе клеток–предшествеников миелоидного ряда и охарактеризовать маркёрные структуры общего миелоидного (CD45RA^–ИЛ–3Ra^lo), гранулоцитарно-моноцитарного (CD45RA⁺ИЛ–3Ra^lo) и мегакариоцитарно-эритроидного (CD45RA^– ИЛ–3Ra^–) предшественников.

На физиологические процессы дифференцировки стволовых клеток сильное влияние оказывает регуляторная сеть цитокинов, действующих как на стволовые клетки, так и на вспомогательные для них клеточные элементы. Так например, известно, что СКК человека фенотипа CD34 преимущественно дифференцируются в эритроидные клетки под влиянием эритропоэтина, под влиянием фактора стволовых клеток (ФСК) и Г–КСФ — преимущественно в гранулоцитарные клетки. М.О. Muench и соавт. [423] определяли in vitro влияние различных факторов на дифференцировку клеток–предшественниц фенотипа CD34⁺⁺CD38⁺Lin^– фетальной печени человека в NK (CD56⁺CD3^–) и в B–лимфоциты (CD19). Оказалось, что наилучшие условия для дифференцировки клеток–предшественниц в NK обеспечивают ИЛ–15 и kit–лиганд (KL), который были способны частично замещать flk–2/flt3–лиганд (FL), ГМ–КСФ, ИЛ–3 или ИЛ–7. Все эти цитокины поддерживали также рост предшественников NK из кандидатных СКК. Однако наибольшее число клеток фенотипа CD56 формировалось под влиянием комбинированного действия KL, FL, Г–КСФ и ИЛ–15. Комбинированное действие KL, FL и ИЛ–7 обеспечивало дифференцировку клеток–предшественниц в B–лимфоциты. В этом случае ГМ–КСФ, ИЛ–3 и ИЛ–15 не влияли на формирование B–лимфоцитов из предшественников фенотипа CD34⁺⁺CD38^–Lin^–, а ГМ–КСФ угнетал их образование из предшественников фенотипа CD34⁺⁺CD38⁺Lin^–.

Пока недостаточно изучена минимально необходимая, также как и оптимальная, потребность в цитокинах для индукции дифференцировки клеток–предшественниц, однако к настоящему времени получены чёткие доказательства возможности индукции дифференцировки СКК в отдельные линии зрелых клеточных форм. Так, при 2-недельном культивировании клеток фенотипа CD34 пуповинной крови человека в бессывороточной среде, содержащей фактор стволовых клеток, лиганд Flt3, Г–КСФ и мегакариоцитарный фактор роста и развития клеток, в культуре регистрировали формирование предшественников B–, NK- и T–лимфоцитов. В течение 5 месяцев после трансплантации мышам NOD–SCID растущей популяции клеток у животных выявлялись предшественники лимфоидных и миелоидных клеток. Более того, выделенные из костного мозга таких животных прижившиеся клетки фенотипа CD34⁺CD19^– формировали в культуре B–лимфоциты фенотипа CD19⁺, CD56⁺CD3^– — NK–лимфоциты, CD4⁺CD8⁺TCR⁺ — T–лимфоциты [325]. В случае культивирования in vitro клеток фенотипа CD34, выделенных их костного мозга здоровых лиц, и обработанных рекомбинантными человеческими цитокинами ГМ–КСФ, TNF–a, ФСК в присутствии ИЛ–4, регистрировали формирование дендритных клеток, несущих линейноспецифический маркёр HLA–DM[610]. Функционально активные антигенпредставляющие дендритные клетки могут быть получены в бессывороточной среде in vitro из клеток фенотипа CD34 и с помощью другого набора цитокинов — ГМ–КСФ, гипер-ИЛ–6 и ФСК. Это можно объяснить тем, что в индуцируемых цитокинами процессах дифференцировки клеток–предшественниц участвуют различные рецепторные молекулы, одновременно экспрессируемые на клеточной поверхности, или Рц, экспрессия которых может различаться на клетках–предшественницах различной степени дифференцированности. Возможны и другие объяснения наблюдаемых явлений. Однако, вне зависимости от их механизмов, является очевидной настоятельная необходимость дальнейшего изучения регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток, в т.ч. и исследования роли отдельных цитокинов или их комбинаций в стимуляции реализации потенций СКК.

Следует отметить, что цитокины оказывают на СКК не только стимулирующее действие. В механизмах поддержания физиологического гомеостаза не менее значимым является ингибирующее действие цитокинов, одной из мишеней которого являются СКК. Несмотря на выраженную пролиферативную активность потомков клеток–предшественников, наиболее примитивные стволовые клетки находятся в состоянии относительного покоя. Так например, для эффективного заселения и приживления клеток–предшественниц мышам NOD–SCID требовалось трансплантировать в 10–1000 раз больше клеток фенотипа CD34^– (в среднем в 100 раз), по сравнению с клетками фенотипа CD34⁺ [246]. Считают, что в неактивном состоянии стволовые клетки поддерживает трансформирующий фактор роста–b1 (ТФР–b1). Низкие физиологические дозы ТФР–b1 не индуцируют клеточного апоптоза, но предотвращают быструю утрату поверхностного Аг CD34 и повышают его экспрессию до входа клеток в S–фазу клеточного цикла, а также повышают уровень экспрессии Аг CD34 на клетках, ускользнувших от супрессивного действия других молекул, подавляющих клеточный цикл. Действие ТФР–b1 на клетки обратимо. Мутации ТФР– b1 и нарушения сигнальных путей, опосредующих действие ТФР– b1, сопровождаются развитием неопластической пролиферации примитивных стволовых клеток/клеток предшественников. Показано также, что блокада аутокринного и эндогенного ТФР– b1 в культуре недифференцированных стволовых клеток/клеток–предшественниц приводит к индукции клеточного цикла высокого пролиферативного потенциала [129]. Исследование механизмов действия ТФР–b1 установило, что эффект этих молекул на клетки опосредован циклинзависимым ингибитором киназы p21(cip1). Оказалось, что недифференцированные клетки фенотипа CD34 под действием ТФР–b1 экспрессируютp21(cip1), подавляющий вступление клеток в клеточный цикл. Кроме того, p21(cip1) контролирует процесс дифференцировки более зрелых миелоидных клеток. Показано, что действие АТ к эндогенному ТФР–b1 приводит к быстрому снижению уровня мРНК p21(cip1) и усилению пролиферации клеток, тогда как при действии ТФР–b1 экспрессия мРНК p21(cip1) усиливается, а пролиферация клеток–предшественниц подавляется [213]. Считают, что молекула р21 является молекулярным переключателем, регулирующим вступление стволовых клеток в клеточный цикл; дефицит р21 сопровождается нарушением самоподдержания пула стволовых клеток и её истощением [185]. Предполагается возможная независмость контроля ТФР–b1 процессов клеточной пролиферации и их дифференцировки [129].

Уникальную роль в опосредованном цитокиновыми Рц внутриклеточном сигнализировании, обеспечивающем размножение и дифференцировку СКК, играет система JAK-STAT — система киназ Янус (JAK — от JAnus Kinases) и преобразователя сигналов и активатора транскрипции (STAT — от Signal Transducer and Activator of Transcription). При нарушении этой системы развиваются нарушения гемопоэза, включая лейкоз и тяжёлый комбинированный иммунодефицит [439]. Показано вовлечение этой системы в процессы регуляции функций СКК через молекулы STAT5a, но неSTAT1–4, 5b или 6, активируемые взаимодействием Рц Flt3 с соответствующим лигандом. Тирозинкиназы JAK при этом не активировались [614].

Flt3, который, как и молекулы kit и fms, относят к семейству Рц тирозинкиназы класса III, играет важную роль в функционировании СКК, NK и дендритных клеток. Система Flt3 широко используется для усиления процессов мобилизации СКК, Flt3–лиганд способен индуцировать мультилинейную дифференцировку СКК in vitro и in vivo.

Значимую роль в передаче сигнала, индуцируемого различными факторами роста и цитокинами, играет тирозинфосфатаза SHP–2. Эта молекула содержит внутриклеточный домен SH–2, обеспечивает передачу сигнала от клеточной поверхности к ядру и является критическим внутриклеточным регулятором в опосредовании клеточной пролиферации и дифференцировки [481].

Помимо целого ряда цитокинов, в регуляцию функций СКК вовлечены члены семейств хемокинов C–С, C–Х–С и С. Среди изученных регуляторных молекул обнаружены хемокины, обеспечивающие хемотаксис стволовых клеток, хемокины, угнетающие дифференцировку клеток–предшественниц в миелоидном направлении, и хемокины, обеспечивающие выживание стволовых клеток после удаления ростовых факторов [612].

Как отмечалось выше, определение маркёрных структур СКК представляется крайне важным способом идентификации этих клеток. Этот способ обычно применяют в клинической практике для контроля обогащенного СКК трансплантата гемопоэтических клеток, предназначенного для терапевтического применения, например для пересадки при отдельных иммунодефицитах или костномозговой недостаточности, обусловленной, в частности, использованием лучевой и/или химиотерапии. Определение клеточного фенотипа, в том числе и СКК, вообще является одним из важнейших элементов разрабатываемых в настоящее время клеточных технологий, направленных на терапию ряда тяжелейших патологических состояний, таких например, как злокачественные новообразования [12]. Однако, по ряду причин, для изучения характеристик СКК недостаточно одного лишь определения маркёров. Во–первых, структуры, маркирующие СКК, могут присутствовать не только на гемопоэтических клетках, но и на клетках других линий дифференцировки. Во–вторых, для использования СКК в практической медицине необходима не только их идентификация, но и определение характера их дифференцировки и способности к самоподдержанию.

Сразу же отметим, что в настоящее время нет оптимальных систем для идентификации и характеристики СКК человека. Для этих целей используют ряд экспериментальных систем, суммация данных которых позволяет делать определённые выводы.

Одним из апробированных и достаточно давно применяемых инвитровых методов является метод LTC–IC (от — Long-Term Culture — Initiating Cell assay) для характеристики самоподдерживающей активности или способности к мультилинейной дифференцировке примитивных или первично покоящихся клеток–предшественников. По этому методу кандидатные клетки культивируют в течение 5–10 недель на прилипающих костномозговых стромальных клетках, то есть в микроокружении, подобном костномозговому. После этого культивируемые клетки переносят на содержащую цитокины полутвёрдую среду. В такой системе клетки первичной культуры, сохранившие пролиферативную способность, формируют колонии клеток миело-эритроидного типа или колонии B–лимфоцитов. Следует специально подчеркнуть важность качественности компонентов, используемых для культвирования клеток в такой системе, также как и стромальных клеток. Известно, например, что стромальные клетки высокочувствительны к радио- или химиотерапевтическим воздействиям, особенно в отдаленной перспективе [127]. Получение стромальных клеток от особей, подвергавшихся таким воздействиям, равно как и от доноров, страдающих остеопорозом, может оказать существенное влияние на результаты исследования.

Помимо костномозговых стромальных клеток человека или мышей, для культивирования стволовых клеток человека используют эпителиальные клетки тимуса. Применяют и макропористые коллагеновые субстраты.

Не менее сложны и чувствительны к различным воздействиям методы, используемые для культивирования гемопоэтических клеток человека in vivo. Для этих целей обычно используют мышей с комбинированными иммунодефицитами, неспособных отторгать ксенотрансплантаты. Существуют модельные системы на линиях мышей SCID (от англ. Severe Combined Immunodeficiency Disease) с дефицитом T– и B–лимфоцитов [119]; bnx (beige/ nude /xid) с дефицитом не только T– и B–клеток, но и NK; а также NOD–SCID — потомстве от возвратного скрещивания мышей SCID с нетучными, страдающими диабетом, мышами NOD (от NonObese Diabetic mice) — с дефицитом T– и B–лимфоцитов, NK, макрофагов и АПК. Используют также мышей SCID, которым, с целью создания более благоприятного микроокружения для клеток человека, подсаживают клетки человеческого плода — кости, тимуса, печени или лимфатических узлов (модель SCID–hu), и вводят рекомбинантные цитокины человека (или создавют условия для продукции таких цитокинов путём генетических модификаций), обеспечивающие необходимые условия для размножения и мультилинейной дифференцировки исследуемых клеток–предшественниц.

Однако, несмотря на большую значимость созданных модельных систем для изучения свойств СКК и их широкое использование в экспериментальных исследованиях, особенно мышей NOD–SCID, их применение все же ограничено по ряду причин. Обычно, с целью лучшего приживления пересаживаемых клеток, особенно в случае ксеногенных химер, реципиентов подвергают радиационному воздействию. Однако мыши SCID характеризуются высокой чувствительностью к ионизирующему излучению, а мыши NOD–SCID — невысокой продолжительностью жизни — около 6 мес. Более того, у мышей NOD–SCID трансплантируемые клетки преимущественно дифференцируются в направлении B–лимфопоэза и редко — в направлении T–клеточного развития. В связи с этим были предприняты попытки разработать новые модельные системы, которые бы исключили выявившиеся недостатки. В результате были получены мыши, которые помимо указанных выше дефицитов иммунокомпетентных клеток, характеризуются недостаточностью экспрессии Аг гистосовместимости класса I и нарушением распознавания пептидных молекул лимфоцитами фенотипа CD8 (нокаут гена b₂–микроглобулина), дефицитом TCR или BCR (нокаукт гена для RAG1 и мутация в молекуле RAG2), дефицитом рецепторов для ИЛ–2, ИЛ–4, ИЛ–7, ИЛ–9, ИЛ–13 и ИЛ–15 (нокаут гена и мутация в общей g–цепи для цитокиновых Рц) и т.д. Для культивирования клеток–предшественниц и изучения их функций предложена также модельная система с трансплантацией стволовых клеток человека плоду овцы [111].

Значимость разработанных моделей для изучения особенностей функциональной активности клеток–предшественниц могут характеризовать показатели по анализу способности стволовых клеток человека заселять костный мозг мышей NOD–SCID и формировать предшественники лимфоидных и миелоидных клеток [329]. Такие клетки обозначили как SRC (от — SCID Repopulating Cells). Оказалось, что доля SRC в крови пупочного канатика человека составляла 1 на 9, 3´ 10⁵ мононуклеаров. У мышей NOD–SCID с дефицитом b₂–микроглобулина — NOD–SCID/b₂(null) выявлялось в 11 раз больше SRC, по сравнению с мышами NOD–SCID. Более того, введения мышам 8´ 10⁴ мононуклеаров крови пупочного канатика человека было достаточно для регистрации в костном мозгу мышей NOD–SCID/b₂(null) мультилинейной дифференцировки клеток–предшественниц. Показано также, что для приживления определимых количеств SRC у вторичных реципиентов было достаточно трансплантировать мышам NOD–SCID/b₂(null) всего 2, 5´ 10³ клеток фенотипа CD34, выделенных от первичных реципиентов — мышей NOD–SCID.

Отметим и другое. С одной стороны, уникальные по сложности экспериментальные системы, используемые для идентификации СКК человека и изучения свойств стволовых клеток на разных этапах их развития, позволяют получить важнейшие сведения, открывающие новые горизонты в молекулярной биологии, в том числе и в понимании основ физиологии иммунной системы. С другой стороны, именно эта сложность объясняет невоспроизводимость многих данных, получаемых разными исследователями.

Как уже отмечалось, миграция и рециркуляция СКК — важнейшие свойства, характеризующие эти клетки. Первое чёткое доказательство способности стволовых клеток к миграции получено в экспериментах, которые показали, что в периферической крови содержатся клетки, обладающие функцией стволовых. Посредством специальных экспериментальных приёмов, в основе которых лежит количественный учет стволовых клеток, мигрирующих в кровоток, удалось рассчитать интенсивность циркуляции стволовых элементов.

Использованная система подсчёта стволовых клеток основывалась на наблюдениях J.E. Till и Е.А. McCulloch, установивших, что клеточные взвеси, содержащие в своём составе стволовые кроветворные клетки, при пересадках летально облученным реципиентам формируют очаги кроветворения в селёзенке таких животных с превалированием колоний эритроидного типа над колониями гранулоцитарного типа, их соотношение составляет ~2: 1. Было показано, что каждую селезёночную колонию образует одна стволовая клетка и это явилось инструментом для их количественного подсчёта в различных экспериментальных условиях в норме и при разных воздействиях. Стволовые клетки, формирующие очаги кроветворения в селёзенке облученных реципиентов (колонии кроветворных клеток), получили обозначение CFU (от — Colony Forming Units), или КОЕ (колониеобразующие единицы).

В экспериментах Р.В. Петрова и Р.М. Хаитова [47] мышей облучали с экранированием участка костного мозга и определяли репопуляцию СКК в облученные ткани и в кровь. Полученные данные свидетельствуют о том, что быстрая репопуляция гемопоэтических тканей у облученных (при экранировании участка костного мозга) мышей связана с выходом в кровоток СКК, которые циркулируют в организме, заселяя облученные ткани. В последующих опытах была сделана попытка ответить на вопрос, обусловлено ли восстановление именно миграцией СКК или ведущее значение имеет гуморальная стимуляция из необлученных участков. Для решения этого вопроса осуществили парабиотическое соединение мышей сингенных линий СВА/Н и СВА/Н-Т6Т6, клетки которых различимы по хромосомным маркёрам. До операции одного партнёра облучали тотально, а второму при этом экранировали задние конечности. Хромосомный анализ клонов СКК (колоний) в селёзенке тотально облученного парабионта показал, что все колонии образовались из СКК, мигрировавших из экранированного костного мозга. Уверенность в этом послужила отправным моментом для количественной оценки интенсивности миграции СКК из костного мозга [47]. Мышам во время облучения в дозе 800 Р экранировали правую заднюю конечность. Затем через разные интервалы времени локально облучали в той же дозе экранированные участки. Спустя 8 суток после второй экспозиции извлекали селезёнки и подсчитывали количество колоний, формируемых СКК. Оказалось, что увеличение числа колоний в селёзенке зависит от времени между облучениями и числа мигрирующих за это время СКК. Таким образом, полученные результаты демонстрируют активную рециркуляцию СКК.