Механизмы рециркуляции лимфоцитов

Механизмы рециркуляции, в частности хоминга, лимфоцитов были раскрыты при исследовании молекул адгезии, их экспрессии на клетках крови и сосудистого эндотелия и участия в процессах выхода клеток из крови в ткани с преодолением барьера в виде сосудистой стенки [279, 334]. Оказалось, что механизмы выхода лейкоцитов в очаг воспаления и поступления лимфоцитов из крови в лимфоидные органы в процессе рециркуляции практически идентичны. Суть их сводится к следующему. Лейкоциты, в том числе лимфоциты, несут на поверхности такие молекулы адгезии, как L–селектины (распознают свободные остатки гликоконъюгатов), интегрины (распознают иммуноглобулиноподобные молекулы группы ICAM), а также Рц этих молекул. Клетки сосудистого эндотелия в норме почти не экспрессируют молекулы адгезии [324]. Однако при активации в очагах воспаления цитокинами (гуморальными продуктами клеток иммунной системы) клетки плоского эндотелия приобретают высокую кубовидную конфигурацию и экспрессируют Е–селектин, а также Рц для селектинов и интегринов (рис. 26). При этом создаются условия для формирования контактов между лейкоцитами и клетками эндотелия, обусловленных взаимодействием молекул адгезии. Сначала это слабые контакты, опосредуемые селектинами (рис. 27). Затем под влиянием хемокинов (хемотаксических цитокинов) усиливается экспрессия интегринов и их вовлечение в формирование контактов. Клетка прочнее прилипает к сосудистой стенке. Благодаря хемотаксису, обусловленному хемокинами, лейкоцит перемещается между эндотелиальными клетками вглубь ткани.

Рис. 24. Миграции Τ - и B–лимфоцитов в лимфатическом узле.

Рис. 25. Миграция B– и T–лимфоцитов в селёзенке (схема).

Рис. 26. Активация зндотелиальных клеток (схема).

Рис. 27. Миграция лейкоцитов (Л) из сосудистого русла в ткань (схема).

При рециркуляции лимфоцитов (рис. 28) все происходит, в принципе, так же. Однако в отличие от всех остальных тканей в лимфатических узлах и пейеровых бляшках эндотелий посткапиллярных венул в норме является высоким, активированным и несет на своей поверхности молекулы адгезии, взаимодействуя с которыми лимфоциты проникают из циркуляции в орган [334]. Ключевая роль при этом принадлежит L–селектинам и ряду других молекул — «Рц хоминга», к которым относится CD44, распознающий остатки гиалуроновой кислоты. Направление перемещения лимфоцитов различных классов и их преобладающая локализация зависят от спектра хемокинов, специфичных для лимфоцитов, которые вырабатываются теми или иными участками стромы лимфоидных органов. В селёзенке лимфоцитам не требуется преодолевать сосудистый барьер, так как в её краевой зоне кровь как бы свободно изливается в ткань. Однако последующую «сортировку» клеток внутри органа определяют описанные сигналы хемокинов. Кратковременность пребывания лимфоцитов (особенно T–класса) в органах связана с их подвижностью и слабостью связи со стромой (т.е. слабой выраженностью адгезии).

Рис. 28. Хоминг лимфоцитов (схема).

Таким образом, периферический отдел иммунной системы можно представить как комплекс лимфоидных органов, дренирующих определённые участки тела, а также скоплений лимфоидных клеток в барьерных тканях вместе с объединяющими их путями рециркуляции лимфоцитов. При этом лимфоидные популяции находятся в динамическом состоянии, обусловленном постоянным обновлением и рециркуляцией лимфоцитов. Такая структурная организация иммунной системы является, по-видимому, оптимальной для выполнения иммунных функций по защите организма от агрессии чужеродных биологических агентов.

Уже упоминалось (глава 2), что клоны T–хелперов, способные распознать комплекс антигенного пептида с молекулой комплекса гистосовместимости класса II, составляют небольшую часть всей популяции CD4–лимфоцитов, что делает маловероятным их контакт с АПК. Однако вероятность таких межклеточных контактов повышается во много раз благодаря механизмам так называемого «улавливания» циркулирующих лимфоцитов. Суть его состоит в следующем. При прорыве барьеров и начале агрессии в определённом участке организма быстро развивается воспаление, в которое вовлекается региональный лимфатический узел. Это сопровождается временной задержкой в нем рециркулирующих лимфоцитов, по преимуществу T–класса. Параллельно в узел поступают АПК, несущие антигенный пептид. Контакт АПК с T–лимфоцитами специфического клона приводит к его иммобилизации, тогда как остальные клоны продолжают процесс рециркуляции. В результате в региональном лимфатическом узле избирательно скапливаются T–клетки тех клонов, которые распознают Аг и которым предстоит реагировать на него.

Механизм «улавливания» был доказан в экспериментах на мышах. Показано, что мышиные лимфоциты, меченные Н³-тимидином и введенные внутривенно сингенным реципиентам, иммунизированным эритроцитами барана в подушечки лап, избирательно собирались в региональных лимфатических узлах. Предварительная иммунизация доноров клеток значительно повышала число клеток, оседавших в лимфатических узлах, содержавших этот Аг, вернее, Аг, представленный на мембране АПК. Для определения места улавливания лимфоцитов (на свободном Аг или макрофагах, или других АПК, поглотивших этот Аг) реципиентам в подушечки лап вводили клетки перитонеального экссудата, фагоцитировавшие эритроциты барана. Преимущественная задержка иммунных лимфоцитов наблюдалась в региональных лимфатических узлах. Следовательно, иммунные клетки фиксируются на АПК, благодаря антигенным детерминантам, представленным на поверхности последних. Для определения происхождения клеток, участвующих в феномене улавливания, иммунизированным реципиентам вводили B–клетки или T–клетки. Оказалось, что в лимфатических узлах, содержащих антигенные комплексы на поверхности АПК, собираются из циркуляции преимущественно T–клетки.

На рисунке 29 приведена схема улавливания специфических клонов T–лимфоцитов. Непосредственный контакт АПК (несущих соответствующий антигенный пептид) с T–лимфоцитами специфического клона приводит к его захвату в соответствующем лимфоидном органе, тогда как остальные клоны продолжают процесс рециркуляции [72]. В результате в региональном лимфоидном органе избирательно скапливаются T–клетки только тех клонов, которые распознают Аг.

Итак, рециркуляция T– и B–лимфоцитов (и других иммуноцитов) между лимфоидными органами и тканями имеет важнейшее значение для инициации иммунного ответа, давая возможность АПК, локализованным в том или ином участке тела, отбирать специфические клоны лимфоцитов из рециркулирующего пула.

· Глава 4
B–супрессорные лимфоциты

B–клеточная супрессия in vivo

Как отмечалось выше (глава 2), система иммунитета — сложная многокомпонентная организация лимфоидной ткани, располагающейся в разных участках организма в виде центральных и периферических органов иммунитета и ряда иммунных подсистем (кожи, слизистых, мозга и др.). Эта система в физиологических условиях функционирует как единое целое в результате многоуровневого контроля составляющими её регуляторными клеточными системами посредством продуцируемых медиаторов. Совершенно очевидно, что в зависимости от глубины поломок и скорости их нормализации нарушение таких регуляторных систем сопровождается развитием широкого спектра патологических состояний — от отдельных дефицитов на уровне функционирующих систем до системных нарушений с хронизацией заболевания или нарушений, несовместимых с жизнью. Выявление таких регуляторных систем и понимание механизмов их функционирования является важнейшей задачей дисциплины, обозначенной нами как физиология иммунной системы. Среди них одной из важнейших, сравнительно недавно открытых, является регулярная система B–супрессоров, контролирующая уровень иммунного ответа в периферических отделах системы иммунитета и запрещающая его развитие на территории костного мозга — центрального органа иммунитета.

Впервые супрессия антителогенеза B–лимфоцитами была обнаружена при изучении влияния трансплантации лимфоидных клеток из различных источников на иммунный ответ реципиентов разных линий, оппозитно реагирующих на эритроциты барана (ЭБ) [467]. Мышам линий СВА и C57BL, соответственно высоко- или низкоотвечающим на ЭБ, переносили внутривенно сингенные клетки лимфатических узлов, селезёнки, костного мозга или тимуса вместе с ЭБ и определяли число антителообразующих клеток (АОК), накапливающихся в селёзенке реципиентов. Оказалось, что перенос клеток костного мозга, тимуса, селезёнки или лимфатических узлов мышам C57BL значительно повышает их иммунный ответ. Однако введение клеток костного мозга, селезёнки или лимфатических узлов, но не тимоцитов, мышам СВА приводит к 50–60%-ному угнетению иммунного ответа.

Поскольку среди костномозговых клеток содержится небольшое число T–лимфоцитов, а клетки тимуса не вызывали супрессии иммуногенеза, полученные результаты были истолкованы как свидетельство B–клеточной супрессии.

В пользу предположения о B–клеточной природе выявленной супрессии свидетельствовали и некоторые другие данные. Показано, что введение животным циклофосфамида в определённых дозах приводит к поражению преимущественно B–клеток: однократная инъекция препарата в дозе 300–400 мг/кг сопровождается резким опустошением B–зон в лимфатических узлах и селёзенке мышей. T–зоны этих органов заметно не опустошаются даже при трехкратном введении указанных доз циклофосфамида.

Вышеизложенное послужило предпосылкой для проведения опытов по влиянию циклофосфамида в дозе 300 мг/кг на эффект супрессии антителогенеза при трансплантации лимфоидных клеток. Результаты опытов можно было рассматривать как следствие достаточно выраженного избирательного «выбивания» B–клеток, в том числе подкласса B–супрессорных клеток: предварительная обработка доноров клеток селезёнки или лимфатических узлов циклофосфамидом полностью снимает супрессивное действие трансплантированных клеток [467, 470].

Более доказательными следует считать опыты с фракционированными T– и B–клетками, свидетельствующие о существовании подкласса B–супрессоров.

Показано, что перенос относительно больших доз B–клеток от B–мышей подавляет иммунный ответ на ЭБ как у высокоотвечающей на ЭБ линии мышей СВА, так и у низкоотвечающей на этот Аг линии мышей C57BL [470].

В вышеизложенных работах описаны впервые полученные данные о супрессии клетками B–лимфоцитарного ряда гуморального иммунного ответа, то есть антителогенеза.

Вместе с тем показано, что B–клетки супрессируют также клеточный, то есть опосредованный T–лимфоцитами иммунитет. Косвенные свидетельства [469] принесли опыты, в которых было установлено, что обработка животных циклофосфамидом в дозах, избирательно влияющих преимущественно на B–клетки, повышает реакции ГЗТ.

B–клеточная супрессия in vitro

Хотя в различных экспериментальных моделях in vitro было показано, что клетки костного мозга продуцируют факторы, стимулирующие антителогенез как в инициативной, так и в продуктивной фазе, оказалось, что непосредственное добавление клеток костного мозга в культуры лимфоидных клеток подавляет продукцию АТ к различным Аг [49–51, 53, 60, 239].

На рисунке 30 показано, что добавление клеток костного мозга в культуру клеток селезёнки, стимулированных ЭБ, супрессирует накопление АОК, не влияя на клеточную выживаемость [50].

В связи с этим представляет большой интерес диссоциация стимулирующего и супрессирующего эффектов клеток костного мозга, выявленная в серии работ [49, 50]. Авторы культивировали в двухкамерных флаконах in vitro клетки селезёнки и костного мозга в смеси или разделёнными миллипоровой мембраной, непроницаемой для клеток (рис. 31). Во все культуры добавляли ЭБ. Оказалось, что реализация костным мозгом гуморального фактора, стимулирующего продукцию АТ, не требует прямого контакта между клетками костного мозга и селезёнки. Гуморальный фактор костного мозга, супрессирующий продукцию АТ, вырабатывается только при контакте клеток костного мозга с активно пролиферирующими стимулированными Аг лимфоцитами селезёнки. В этих опытах совместное культивирование клеток костного мозга и селезёнки мышей линии СВА, разделённых миллипоровой мембраной в двухкамерных флаконах, приводит к стимуляции продукции АОК и сопровождается усилением синтеза ДНК клетками селезёнки. Однако в случае культивирования смеси клеток селезёнки с клетками костного мозга в одной, и клеток селезёнки — в другой камере, в последней происходит практически полное подавление накопления АОК и синтеза ДНК.

Рис. 29. Схема Улавливание специфических клонов лимфоцитов в региональном лимфатическом узле (ЛУ) (схема).

Рис. 30. Кинетика антителообразования в моно- и смешанных культурах клеток селезёнки и костного мозга. АОК — антителообразующие клетки; КС — клетки селезёнки; ККМ — клетки костного мозга; сплошная линия — кинетика АОК; прерывистая линия — выживаемость клеток.

Рис. 31. Диссоциация стимулирующего и супрессирующего эффектов клеток костного мозга в системе культивирования клеток во флаконах с двойными камерами, разделёнными миллипоровой мембраной. КС — клетки селезёнки; ЭБ — эритроциты барана; ККМ — клетки костного мозга; АОК — антителообразующие клетки. Кривые показывают включение ³Н-тимидина; столбики — число АОК.

Р.В. Петров и соавторы [469] для изучения влияния специфической иммунизации на активность костномозговых супрессоров иммунизировали мышей-доноров костного мозга за 2, 5 и 8 дней до извлечения костномозговых клеток. Установлено, что костномозговые клетки, полученные от предварительно иммунизированных мышей, подавляют антителогенез в культурах клеток селезёнки в такой же степени, как и клетки костного мозга интактных животных.

В других опытах для определения природы костномозговых супрессоров клетки костного мозга инкубировали с антисыворотками против B– или T–лимфоцитов и комплементом. Оказалось, что обработка костного мозга антисыворотками, обладающими специфической цитотоксичностью по отношению к B–, но не к T–лимфоцитам, значительно снижает иммуносупрессорную активность клеток костного мозга [239, 470]. По данным других авторов [470], B–супрессоры резистентны к антимакрофагальной сыворотке, удаление из костного мозга макрофагов с помощью карбонильного железа или адсорбцией их на стекле не отменяло супрессивную активность клеток костного мозга.

Резюмируя вышеизложенное, можно придти к заключению, что в разнообразных иммунологических системах in vivo и in vitro супрессия гуморального и клеточного иммунного ответа может вызываться определёнными подклассами B–клеток. Однако нельзя было исключить возможность того, что в определённых условиях B–клетки (или какие-то подклассы B–клеток) могут служить источником сигнала, включающим неспецифические супрессорные механизмы на уровне T–клеток по механизму обратной связи.

Исходя из высказанных соображений, Р.М. Хаитов и И.Г.Сидорович совместно с сотрудниками лаборатории профессора R.W. Dutton (отделение биологии Калифорнийского университета, Сан-Диего, США) провели эксперименты, которые позволили полностью исключить роль T–клеток в феномене B–клеточной супрессии. В первом варианте опытов использовали исключительно тимуснезависимую систему индукции первичного IgM–ответа. Для удаления T–клеток суспензии костного мозга и клеток селезёнки предварительно обрабатывали анти–T–сывороткой и комплементом. Затем клетки селезёнки культивировали с тимуснезависимым Аг тринитрофенол–липополисахарид (ТНФ–ЛПС) для индукции ТНФ-специфического иммунного ответа или только с ЛПС для индукции поликлонального ответа и определяли накопление АОК к ТНФ. Добавление в такие культуры клеток костного мозга подавляло как ТНФ-специфический, так и поликлональный иммунный ответ. Во втором варианте опытов исследовали влияние клеток костного мозга, обработанных анти–T–сывороткой и комплементом, на иммунный ответ обработанных аналогичным образом клеток селезёнки к тимусзависимому Аг — ЭБ. Отсутствие T–клеток–хелперов компенсировали добавлением в культуры тимуc–замещающего фактора, индуцированного конканавалином А (КонА) в культуре T–лимфоцитов. Отсутствие T–клеток не влияло на супрессорное действие костного мозга.

Р.М. Хаитов и соавторы [60, 70] исследовали распределение B–супрессоров, угнетающих антителогенез in vitro, в лимфоидных тканях нормальных мышей, мышей с искусственным T–дефицитом, то есть B–мышей (тимэктомированные летально облученные, восстановленные костным мозгом животные), и мышей nude с генетически детерминированным отсутствием тимуса. Показано, что клетки костного мозга B–мышей и мышей nude оказывают такое же эффективное супрессорное действие на антителогенез в культурах нормальных клеток селезёнки, как и клетки костного мозга нормальных мышей. В лимфатических узлах нормальных животных, B–мышей и мышей nude cyпрессорные клетки, угнетающие продукцию АОК клетками селезёнки, отсутствуют. Супрессоров этого типа нет также в селёзенке интактных мышей и мышей nude. Однако добавление клеток селезёнки B–мышей в культуры спленоцитов интактных мышей приводит к значительной супрессии иммунного ответа.

Таким образом, в интактном организме супрессоры костномозговой природы, угнетающие антителогенез in vitro, содержатся только в костном мозгу. Миграции их в селёзенку и лимфатические узлы в физиологических условиях, по-видимому, не происходит.

Сотрудники нашей лаборатории А.А. Батырбеков, Е.В. Кожинова, С.Ю. Пчелинцев, И.Г. Сидорович и др. исследовали уровень костномозговых B–супрессоров при старении. Было показано, что старение не сопровождается снижением активности этих клеток. Более того, в костном мозгу мышей в возрасте 22–28 месяцев активность костномозговых B–супрессоров была существенно повышена, по сравнению с таковой у мышей в возрасте 1, 5–2, 4–5 и 9–11 месяцев, уровень активности которых характеризуется одинаковыми параметрами. Иначе говоря, при старении наблюдается резкое усиление костномозговой супрессии. Полученные нами данные показывают, что в отличие от нормальных животных, у мышей NZB/NZW со спонтанным развитием аутоиммунной патологии активность костномозговых супрессоров в разные возрастные периоды различна — высокая у мышей в возрасте 1, 5–2 месяцев, заметно снижается у 4–5-месячных мышей и в возрасте 9–11 месяцев вновь повышается, достигая уровня активности молодых животных. Анализ полученных данных показал, что в начальный период аутоиммунной патологии у животных происходит снижение супрессорной активности, а в её терминальной стадии — усиление. По-видимому, в период максимального проявления аутоиммунной патологии происходит расселение B–супрессоров из костного мозга в периферические лимфоидные ткани. Ещё большее усиление активности костномозговых B–супрессоров происходит при возникновении у старых аутоиммунных мышей опухолей лимфоидной ткани. У мышей со спонтанным развитием опухолевого процесса (22–28-месячные животные) супрессия клетками костного мозга пролиферативной активности сингенных спленоцитов, регистрируемая по включению тимидина, меченного тритием, была выражена в 13 раз более сильно, по сравнению с таковой у 22–29-месячных нормальных мышей и была в 30 раз более сильной, по сравнению с супрессорной активностью нормальных 2-месячных животных [470].