B–супрессоры при ответе на антигенную стимуляцию

Исследование особенностей формирования и функционирования B–супрессоров при иммунном ответе на антигенную стимуляцию проводилось в нашем коллективе рядом исследователей — И.Г. Сидоровичем, А.А. Власовым, А.Г. Калинковичем, Б.В. Пинегиным, Р.И. Атауллахановым и др. Основные полученные факты представлены ниже.

Как и в случае с трансплантацией костномозговых клеток, было показано, что перенос сингенным реципиентам спленоцитов мышей, иммунизированных субоптимальной дозой Аг (эритроциты барана), сопровождается существенным снижением числа АОК. Супрессорное действие клеток отменялось при обработке спленоцитов антисыворотками к иммуноглобулинам и комплементом или к специфическому Аг B–лимфоцитов (MBLA) и комплементом, но не антисывороткой к специфическому Аг T–лимфоцитов (Thy–1.2) и комплементом, свидетельствуя о том, что супрессорные клетки иммунных животных относятся к классу B–лимфоцитов. С увеличением дозы Аг от субоптимальной до сверхоптимальной супрессорная активность B–клеток возрастает, однако в этом случае проявляется также супрессорная активность T–лимфоцитов. Важно отметить, что антигенная стимуляция не индуцирует миграцию B–супрессоров из костного мозга. Как было показано выше, ингибирующее действие костномозговых B–супрессоров неиммунных мышей или иммунизированных за 2–8 дней до извлечения костного мозга было одинаково эффективным в культуре спленоцитов, формирующих АОК. Иммунизация мышей индуцирует образование B–супрессоров и в популяции клеток лимфатических узлов, однако, их активность меньшая, по сравнению с костномозговыми B–супрессорами. Важно отметить, что образование B–супрессоров может индуцироваться не только в результате антигеннной стимуляции, но и при действии других факторов — инфекционных агентов, лектинов, иммунных комплексов, иммуноглобулинов [470].

Исследована кинетика формирования B–супрессоров в селёзенке иммунных мышей с использованием разных доз клеток, выделенных в различные сроки после иммунизации животных субоптимальной дозой эритроцитарных Аг и перенесенных сингенным реципиентам одновременно с их иммунизацией эритроцитами барана. Было показано, что с увеличением сроков после иммунизации супрессорная активность одной и той же дозы спленоцитов (5´ 10⁷) нарастает. Опосредованная B–лимфоцитами супрессия иммунного ответа клетками селезёнки, выделенными через 2–4 суток после иммунизации эритроцитарными Аг, была минимальной или отсутствовала и затем возрастала по мере увеличения сроков между иммунизацией и выделением селезёночных клеток, достигая высоких значений через 7–21 дней после иммунизации — 70–85%-ное угнетение формирования АОК.

Эффект супрессии определялся также дозой иммунных B–лимфоцитов. Спленоциты в дозе 5´ 10⁶ супрессорный эффект не проявляли или он был минимальным, доза клеток 10⁷ обеспечивала ~50%-ный эффект супрессии, клетки в дозе 2, 5´ 10⁷ и 5´ 10⁷ подавляли формирование АОК на 70 и 80%, соответственно.

Супрессии подвергались продуценты АТ классов IgM и IgG, B–супрессоры, полученные после повторного антигенного стимула были более активными (75–96%-ное угнетение IgM–AOK и IgG–АОК), их формирование протекало более быстро, по сравнению с первичным ответом. Это свидетельствует о том, что формирование B–супрессоров при первичном иммунном ответе происходит с одновременным образованием их клеток памяти.

Следует отметить, что угнетение антителообразующей функции лимфоцитов под влиянием супрессирующих B–клеток могло быть обусловлено не только активностью иммунных B–супрессоров, но и продуцируемых ими АТ, угнетающими иммунный ответ по типу обратной связи. Об этом же могла свидетельствовать и большая активность B–супрессоров, выделенных после повторной антигенной стимуляции, по сравнению с таковыми, полученными после первичного антигенного стимула. Однако такое предположение не подверждается специально поставленными опытами с переносом иммунных B–супрессоров нормальным сингенным реципиентам за 1–3 или 5–7 дней до их иммунизации. Оказалось, что B–супрессоры являются относительно короткоживущими клетками. Они подавляли формирование АОК на 50–60% в селёзенке реципиентов только при иммунизации последних через 1–3 суток после переноса иммунных B–супрессоров. В случае иммунизации реципиентов через 5–7 суток после переноса клеток эффект супрессии не регистрировался. Совершенно очевидно, что наблюдаемый эффект не опосредован АТ, продуцируемыми иммунными B–супрессорами. Если бы это было так, то уровень супрессии должен был бы возрастать по мере увеличения сроков между переносом клеток и тестированием уровня АОК в связи с нарастанием выработки АТ перенесенными клетками. Как свидетельствуют полученные данные, уровень супрессии не только не увеличивается с увеличением времени между переносом клеток и иммунизацией реципиентов, но и полностью отменяется.

Для изучения характеристики B–супрессоров были использованы различные приёмы. Как отмечалось выше, супрессирующее действие на различные пролиферирующие клетки–мишени (лимфоциты, активированные Аг, митогенами или поликлональным активатором, гемопоэтические клетки–предшественницы, эффекторы гуморального и клеточного иммунитета) оказывают живые, синтезирующие ДНК B–лимфоциты. Наиболее реальным кандидатом на роль B–супрессоров выступают предшественники B–лимфоцитов. Фракционирование иммунных B–клеток по скорости седиментации при 1 g с анализом супрессирующей активности полученных фракций показало, что наибольшая супрессивная активность проявляется во фракции малых, медленно оседающих клеток. Характеристика экспрессии ряда мембранных Рц на селезёночных супрессорных B–лимфоцитах иммунных мышей показала, что такие клетки несут мембранные иммуноглобулины, специфический Аг B–лимфоцитов — MBLA, D–маннозу — Рц для лектина канавалии мечевидной (Canavalia ensiformis — КонА) и N–ацетил-D–глюкозамин — Рц для лектина зародышей пшеницы (Wheat-germagglutinin — WGA), но не экспрессируют Аг Thy–1, D–галактозу — Рц для лектина земляного ореха (Peanut agglutinin — PNA) и N–ацетил-D–галактозамин — Рц для лектина соевых бобов (Soybean agglutinin — SBA) [470].

Заметную роль в супрессорной активности B–лимфоцитов играют клетки, несущие Fc–Рц для IgG. Показано, что супрессорной активностью обладают B–лимфоциты, как экспрессирующие этот Рц (FcR⁺), так и B–лимфоциты не экспрессирующие его (FcR^–). Оказалось однако, что FcR⁺–B–cyпpeccopы селезёнки иммунных мышей подавляют формирование АОК во всех испытанных комбинациях — сингенной (СВА®СВА), полусингенной [CBA® (CBA®C57BL/6J)F₁] и аллогенной (CBA®BALB/c), тогда как иммунные FcR^––B–супрессоры подавляли формирование АОК только в сингенной комбинации донор-реципиент. Более того, при сравнении супрессирующей активности таких клеток в одних и тех же условиях опыта оказалось, что FcR⁺–B–cyпpeccopы существенно более эффективно подавляют формирование АОК, по сравнению с FcR^––B–супрессорами. В случае активации FcR⁺ и FcR^––B–лимфоцитов B–клеточным митогеном (WGA). практически полное угнетение процесса формирования АОК наблюдали при использовании FcR⁺-, но не FcR^––B–лимфоцитов.

При детальном анализе функциональной активности FcR⁺ и FcR^––B–лимфоцитов в системе их переноса нормальным иммунизированным мышам было установлено, что иммунные B–супрессоры подавляют формирование АОК с помощью различных механизмов. Показано, что иммунные FcR⁺–B–cyпpeccopы, как и нефракционированные иммунные B–клетки селезёнки, подавляют формирование АОК, B–клеток памяти и хелперных T–лимфоцитов. Их супрессирующее действие регистрируется только на ранних этапах иммунного ответа, в период интенсивной пролиферации иммунокомпетентных клеток (неделя, но не две, после иммунизации животных). Действие иммунных FcR⁺–B–лимфоцитов характеризуется неспецифичностью, оно не ограничено генами главного комплекса гистосовместимости мышей (Н–2). В отличие от FсR⁺–B–лимфоцитов, иммунные FcR^––B–лимфоциты подавляют формирование АОК опосредованно, за счёт индукции супрессорных T–лимфоцитов. Их действие Аг–специфично, ограничено генами Н–2. Однако сами FcR^––B–лимфоциты в использованной системе не проявляют способности подавлять формирование АОК, B–клеток памяти и T–хелперов. Этот тип супрессии был определен как «B–T–опосредованная иммуносупрессия».

Для изучения механизмов B–клеточной супрессии провели анализ особенностей люминол–зависимого хемилюминесцентного взрыва, регистрируемого в условиях активации селезёночных B–супрессорных лимфоцитов иммунным комплексом (яичный альбумин–IgG–АТ к яичному альбумину), агрегированным IgG или различными митогенами (КонА, WGA, PNA, SBA). Как известно, в люминол–зависимом хемилюминисцентном взрыве, индуцируемом взаимодействием Fc–фрагмента IgG с Fc–Рц B–лимфоцитов, центральную роль играет арахидоновая кислота, отщепляемая от фосфолипидов клеточной мембраны фосфолипазой А₂, активируемой в результате активации клетки иммунным комплексом. Окисление арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути сопровождается образованием гидроксильных радикалов, которые, как считается, непосредственно ответственны за окисление люминола и респираторный взрыв, и простагландинов — медиаторов воспаления, в частности простагландина Е₂, сильного ингибитора продукции АТ.

При проведении экспериментальных исследований использовали неприлипающие к пластику селезёночные клетки, исключающие возможность участия фагоцитов в хемилюминесцентном ответе. Было показано, что наблюдаемый эффект регистрировался только при применении указанных иммунных комплексов и отсутствовал при использовании только яичного альбумина или только IgG–АТ, при замене использованных селезёночных клеток тимоцитами, клетками лимфатических узлов или клетками селезёнки, обогащенными T–лимфоцитами. Вместе с тем, обогащение неприлипающих спленоцитов B–лимфоцитами резко усиливало хемилюминесцентный ответ. Существенно повышенный ответ наблюдался и при замене иммунных комплексов агрегированным IgGили при применении антимышиного кроличьего IgG, но не его Fab– или F(аb')₂–фрагментов. Это исключает участие в наблюдаемом ответе активированных иммуноглобулиновых Рц и подтверждает значимость FcR, экспрессируемых B–супрессорными лимфоцитами.

При анализе роли отдельных лигандов в хемилюминесцентном ответе B–лимфоцитов было установлено, что такие активаторы B–лимфоцитов как ЛПС энтеробактерий или митоген лаконоса не индуцировали хемилюминесцентный взрыв. Вместе с тем, стимуляция B–лимфоцитов КонА и WGA сопровождалась резким усилением наблюдаемого ответа (в 5 и 12 раз, соответственно). Важно отметить, что этот эффект регистрировался при использовании FcR⁺-, но не FcR^––B–лимфоцитов. Считается, что сахара, связывающие КонА и WGA, являются частью FcR или расположены в непосредственной близи от этих Рц. Поэтому наиболее вероятным результатом хемилюминесцентного взрыва, проявляемого Fс⁺–спленоцитами, является взаимодействие указанных лектинов с B–лимфоцитами через FcR.

Суммируя результаты анализа механизмов опосредованной B–лимфоцитами иммуносупрессии можно заключить, что угнетающее действие B–лимфоцитов не является результатом действия специфических АТ и может обеспечиваться через продукцию такими клетками супрессорного фактора (глава 4, раздел «B–клеточная супрессия in vitro»). В механизмах B–клеточной супрессии играют также важную роль простагландины, синтезируемые FcR⁺–B–лимфoцитaми, активированными иммунными комплексами, и ассоциативное образование активных форм кислорода, в частности гидроксильных радикалов. Такое заключение сделано на основании вышеприведенных данных (раздел «B–клеточная супрессия in vitro»), на основании анализа результатов серии выполненных исследований по резкому усилению люминол–зависимого хемилюминесцентного ответа селезёночных B–лимфоцитов при их активации иммунными комплексами (яичный альбумин–IgG–АТ к яичному альбумину), агрегированным IgG или митогенами (КонА, WGA) и по результатам ингибиторного анализа с использованием соединений — ингибиторов фосфолипазы А₂(бромфенацилбромид), циклооксигеназы (индометацин), фосфодиэстеразы (теофиллин), иммунного ответа (простагландин Е₂) и др. [470]. Эти соединения практически полностью подавляли индуцируемый лектинами хемилюминесцентный взрыв.

Помимо B–супрессоров, ограничивающих до физиологически протекающих процессов пролиферативный потенциал иммунокомпетентных клеток, в организме существует и другая регуляторная система, препятствующая неограниченному размножению иммуноцитов и развиваемым ими реакциям гуморального и клеточного иммунитета. Это T–лимфоциты, приобретающие при определённых условиях (активация Аг и пр.) свойства супрессорных клеток. Однако в отличие от этих супрессоров, формирующихся в результате множественной иммунизации или использования больших доз антигенного материала, B–супрессоры, конститутивно присутствующие в кроветворной и лимфоидной тканях и выявляемые до иммунизирующих воздействий — это первая линия физиологических защитных механизмов организма.

Выявление системы B–лимфоцитарной супрессии, изучение происхождения B–супрессорных лимфоцитов, кинетики их формирования, особенностей, генетического контроля, феноменологии и механизмов действия впервые продемонстрировало, что костный мозг в нормальных физиологических условиях является не только источником стволовых клеток, обеспечивающих в процессе онтогенеза формирование всего разнообразия лимфоидных и миелоидных клеток, но и мощной центральной системой, формирующей регуляторные клетки B–ряда, контролирующие протекание иммунологических реакций и предохраняющие организм от неконтролируемого функционирования иммуноцитов. Несмотря на то, что основные экспериментальные доказательства B–клеточной супрессии получены в системе гуморального иммунитета in vivo и in vitro, подавление клеточной пролиферации B–клетками, в том числе и в смешанных культурах, может служить основанием для предположения о проявлении B–лимфоцитарной супрессии и в реакциях клеточного иммунитета.

Справедливость заключения о значимости костного мозга, как системы формирования регуляторных клеток B–ряда, подтверждается проведёнными в нашем коллективе экспериментальными исследованиями по выявлению костномозговых B–хелперов, участвующих в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток (глава 3). Значимость полученных данных заключается в том, что B–хелперы выполняют двойственную функцию — способствуют процессам пролиферации и дифференцировки сингенных стволовых клеток в условиях дефицита регуляторных T–лимфоцитов и усиливают процессы инактивации T–лимфоцитами чужеродных для организма стволовых клеток, как источника клеточных элементов агрессии по отношению к организму хозяина.

Таким образом, система регуляторных клеток B–ряда является важным фактором поддержания генетической целостности организма. Эта система, с одной стороны, на этапах доиммунизирующих воздействий и на ранних этапах иммунного ответа обеспечивает с помощью B–супрессоров регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы и с помощью B–хелперов способствует функционированию стволовых клеток организма, необходимых для поддержания в необходимом объёме пула иммуноцитов. С другой стороны, B–регуляторные клетки способствуют элиминации из организма потенциально опасного для него генетически чужеродного материала.

Как супрессорное, так и хелперное действие B–клеток опосредуется через продуцируемые ими растворимые факторы неиммуноглобулиновой природы. Совершенно очевидно, что дальнейшая разработка проблемы цитокиновой регуляции функций клеток системы иммунитета с помощью факторов, продуцируемых регуляторными B–лимфоцитами, в частности B–супрессорными, представляет существенную значимость как для фундаментальной, так и клинической иммунологии.

· Глава 5
Главный комплекс гистосовместимости: гены иммунного ответа