Генетический контроль, природа и механизмы B–клеточной супрессии

Для изучения генетического контроля Аг–неспецифической супрессии, опосредованной B–клетками костного мозга, в культуры клеток селезёнки добавляли аллогенные или полусингенные клетки костного мозга мышей в различных комбинациях [49]. Оказалось, что гистосовместимость по Н–2-комплексу между костномозговыми B–супрессорами и клетками селезёнки не является обязательным условием для проявления эффекта супрессии иммуногенеза.

И.Г. Сидорович и соавторы [60] показали, что угнетающий эффект костномозговых B–супрессоров на иммуногенез не подвержен ксеногенному ограничению. Внесение в культуры клеток селезёнки мышей (CBA´ C57BL)F₁ эквивалентного количества клеток костного мозга различных видов животных (крысы, морские свинки, куры, свиньи) приводит к такой же супрессии иммунного ответа, как и добавление сингенного или аллогенного костного мозга. Приведенные выше данные свидетельствуют, что супрессия иммуногенеза костномозговыми B–супрессорами не подвержена аллогенному или ксеногенному ограничению. B–супрессорные лимфоциты костного мозга человека также угнетают иммуногенез и клеточную пролиферацию в культурах клеток селезёнки мышей [53].

В системе культивирования клеток во флаконах с двойными камерами было установлено, что в случае непосредственного (в одной камере) контакта клеток костного мозга с клетками селезёнки наблюдается подавление иммуногенеза. Одновременно продуцируется клетками супрессорный фактор, угнетающий накопление АОК и пролиферацию клеток в смежной камере, содержащей только клетки селезёнки [50]. Однако в самой смешанной культуре клеток селезёнки и костного мозга, несмотря на практически полное подавление иммунного ответа, включение в ДНК клеток меченного тритием тимидина достигало высоких значений. Таким образом, наблюдалось некоторое противоречие — в смешанной культуре выделялся фактор, подавляющий пролиферацию, однако пролиферация в этой же культуре оставалась довольно активной. С целью выяснения причин этого несоответствия проведен анализ пролиферативной активности клеток костного мозга и селезёнки в моно- и смешанных культурах в сопоставлении с продукцией АОК в этих культурах [469]. Оказалось, что интенсивное включение Н³-тимидина наблюдается в культурах, содержащих только клетки селезёнки, где развивается высокий иммунный ответ, и в культурах, содержащих смесь клеток селезёнки и костного мозга, в которых АОК не формируются. В монокультурах клеток костного мозга включение Н³-тимидина происходит значительно менее интенсивно. Сопоставление этих данных с результатами хромосомного анализа происхождения пролиферирующих клеток показало, что в смешанных культурах резко усиливается пролиферация костномозговых клеток и полностью подавляется деление селезёночных клеток. Пролиферация костномозговых клеток максимально активируется на 2–3 сутки культивирования, что возможно может быть показателем активации супрессорных клеток и их пролиферации и/или дифференцировки.

Р.М. Хаитов и соавторы [70] исследовали метаболическую «уязвимость» костномозговых клеток-супрессоров. Было установлено, что предварительное прогревание суспензии клеток костного мозга при 56 °C в течение 30 минут, приводящее к тотальной гибели клеток, полностью отменяет их способность супрессировать иммунный ответ в культурах селезёночных клеток. Клетки костного мозга, убитые замораживанием и размораживанием, также не супрессируют антителогенез. Следовательно, только живые клетки костного мозга способны оказывать иммуносупрессорное действие. Более того, для проявления ингибирующих потенций супрессорных B–лимфоцитов клетки костного мозга должны быть способными к синтезу ДНК и пролиферации.

Так, нарушение нормального синтеза ДНК в клетках костного мозга в результате облучения рентгеновскими лучами в дозе 2000 Р, ведущее к нарушению процессов клеточной пролиферации и дифференцировки, сопровождается полной отменой костномозговой супресии иммуногенеза. К аналогичному результату приводит и предварительная обработка клеток костного мозга митомицином С в дозе, обеспечивающей прекращение синтеза ДНК. Эти данные коррелируют с тем, что костномозговые супрессоры являются относительно незрелыми клетками, сравнительно «уязвимыми» для антиметаболических воздействий. С другой стороны, пролиферация зрелых клеток-супрессоров, ведущая к увеличению их количества, может быть необходимым условием проявления супрессорного эффекта.

Сделана попытка конкретизировать положение костномозгового B–супрессора в ряду клеток B–лимфоцитарной линии [239]. Было обнаружено, что предварительное введение мышам оксимочевины в дозах, приводящих к избирательному цитолизу активно пролиферирующих клеток в костном мозгу, сопровождается отменой супрессорного эффекта. В этих же опытах показано, что удаление клеток, несущих поверхностные иммуноглобулины, снижает супрессорную активность костного мозга. После введения оксимочевины общее число клеток в костном мозгу снижалось в 5 раз, однако относительное содержание Ig–позитивных клеток увеличивалось. Следует отметить, что в отличие от обработки оксимочевиной, которая полностью отменяет супрессорный эффект клеток костного мозга, обработка антисыворотками против иммуноглобулинов ведёт к существенной, но не полной отмене супрессорного эффекта возможно из-за присутствия среди супрессорных B–лимфоцитов других клеток, обладающих аналогичной функцией. Альтернативно можно допустить, что антисыворотки не способны тотально элиминировать супрессорные B–клетки с низкой плотностью поверхностных иммуноглобулинов. Полное отсутствие супрессоров в костном мозгу обработанных оксимочевиной мышей и одновременное повышение содержания зрелых Ig–позитивных лимфоцитов показывает, что последние не обладают супрессорной активностью. В свете этих данных наиболее вероятным кандидатом на роль костномозговой клетки-супрессора является предшественник B–лимфоцита. Именно эта клетка несет поверхностные иммуноглобулины и активно пролиферирует. Вместе с тем, нельзя полностью исключить участие в супрессии незрелых Ig–позитивных B–лимфоцитов, пул которых после введения оксимочевины истощается вследствие элиминации их предшественников, с одной стороны, и вследствие созревания, с другой стороны. Наконец, существует возможность того, что супрессоры представляют специальную субпопуляцию B–клеток со своим предшественником.

Дискриминативный анализ происхождения пролиферирующих клеток в смешанных культурах, состоящих из равных количеств сингенных, но различающихся по хромосомному маркёру Т6Т6 клеток костного мозга и селезёнки (1: 1), показал, что в основе костномозговой супрессии антителогенеза лежит подавление пролиферации стимулированных Аг клеток селезёнки [50]. Цитогенетической идентификацией установлено, что в первые 2 суток культивирования митотическая активность клеток костного мозга и клеток селезёнки в смешанных культурах примерно одинакова. Однако через 3 суток после начала культивирования в смешанной культуре почти 80% делящихся клеток были костномозговыми. На 4-й день инкубации практически все делящиеся клетки в смешанной культуре были костномозгового происхождения. Таким образом, к концу инкубации в смешанных культурах прекращается пролиферация селезёночных клеток. При этом сильно активируется деление клеток костного мозга.

Сопоставление кинетики включения Н³-тимидина в моно- и смешанных культурах с кинетикой изменения процента делящихся селезёночных клеток в смешанных культурах позволило установить, что основной эффект супрессии пролиферации клеток селезёночного происхождения в смешанных культурах проявляется через 2–3 суток после начала культивирования и совпадает по времени с сильной активизацией пролиферации клеток в монокультуре спленоцитов, стимулированных Аг [50]. Иначе говоря, основной эффект действия клеток-супрессоров на клетки–мишени проявляется в продуктивной фазе иммунного ответа (через 2–3 суток после иммунизации культуры), когда происходит резкое усиление пролиферации стимулированных Аг клеток селезёнки.

Таким образом, в основе иммуносупрессорного эффекта клеток костного мозга лежит подавление пролиферации клеток–мишеней. Клетками–мишенями являются, по-видимому, все делящиеся клетки селезёнки.

На основании этих данных разработан методически простой и удобный метод оценки активности костномозговых B–супрессоров по определению суммарного включения Н³-тимидина в ДНК клеток в смешанной культуре. Этот метод позволяет изучать супрессию не только стимулированных Аг лимфоидных клеток, но и стимулированных митогеном лимфоцитов, а также клеток–мишеней разного гистологического происхождения, активно синтезирующих ДНК [469].

Показано, что добавление клеток костного мозга в культуры активно делящихся активированных фитогемагглютинином (ФГА) и митогеном лаконоса (МЛ) T– и B–клеток селезёнки приводит к значительному уменьшению включения Н³-тимидина. Отработанная методика оценки супрессорного действия клеток костного мозга по включению клетками Н³-тимидина позволила изучить динамику супрессии пролиферации клеток–мишеней в зависимости от времени совместной инкубации клеток-супрессоров и клеток–мишеней. В этих опытах после 24-часовой стимуляции ФГА и МЛ клетки селезёнки отмывали от митогенов и культивировали ещё 96 часов. Клетки костного мозга добавляли в культуры сразу после удаления митогенов. Анализ включения Н³-тимидина через 24–96 часов после добавления клеток костного мозга показал, что для проявления супрессорного эффекта необходимо совместное культивирование клеток костного мозга и клеток селезёнки не менее 48 часов. Следует отметить, что тест–система супрессии продукции АОК к ЭБ, требующая обязательного 4-дневного культивирования клеток–мишеней, не позволяет определить минимальное время контакта клеток-супрессоров с клетками–мишенями, необходимое для развития супрессорного эффекта.

Во всех предшествующих работах изучали супрессорное действие костного мозга на лимфоциты селезёнки. Представляло интерес выяснить, возможно ли действие костномозговых B–супрессоров на клетки–мишени из других лимфоидных тканей, нелимфоидных тканей и, наконец, в самом костном мозгу. Оказалось, что костномозговые B–супрессоры способны подавлять продукцию АОК к ЭБ в культурах клеток лимфатических узлов и включение Н³-тимидина T– и B–лимфоцитами лимфатических узлов, активированных ФГА и МЛ [469, 470]. Более того, добавление интактных клеток костного мозга в культуры предварительно активированных ЛПС или декстрансульфатом (митогены B–клеток) костномозговых клеток также приводит к супрессии включения Н³-тимидина. Однако добавление клеток костного мозга в монослойные культуры перевиваемых фибробластоподобных клеток из лёгочной ткани хомячка (культура Blld-ii-FaF 28, клон 431) не приводило к угнетению их пролиферативной активности.

Таким образом, изучение супрессорного действия клеток костного мозга на интенсивность включения Н³-тимидина клетками в моно- и смешанных культурах позволило установить, что действие костномозговых супрессоров распространяется не только на активированные Аг клетки селезёнки или лимфатических узлов, но и на стимулированные митогенами клетки селезёнки, лимфатических узлов (в том числе T– и B–клетки), на B–лимфоциты костного мозга. Нелимфоидные клетки (в частности, фибробластоподобные клетки), по-видимому, не чувствительны к действию костномозговых супрессоров.

Показано [470], что удаление костномозговых B–супрессоров предварительной инкубацией с поливалентной антииммуноглобулиновой сывороткой и комплементом сопровождается усилением клеточной пролиферации, индуцированной B–клеточными митогенами (табл. 14), которые стимулируют пре–B–клетки и пре-АОК.

Удаление B–супрессоров приводит также к значительному увеличению количества делящихся стволовых клеток (табл. 14) при культивировании костного мозга in vitro (для элиминации делящегося пула КОЕ клетки костного мозга обрабатывали «горячим» тимидином). Напротив, добавление надосадочной жидкости, полученной из смешанных культур клеток костного мозга и селезёнки и обладающей супрессивной активностью, сопровождается 6-кратным уменьшением пропорции делящихся стволовых клеток, выявляемой методом тимидинового «самоубийства» в культурах клеток костного мозга (табл. 15). Выживаемость клеток в культурах при этом не снижалась. Возможно, что обнаруженная способность костномозговых B–супрессоров ограничивать пролиферацию клеток–предшественниц в самом костном мозгу отражает их естественную функцию регулировать пролиферацию стволовых клеток. В нормальном костном мозгу мышей, в зависимости от использованной популяции животных, от 70 до 90% стволовых клеток находится в состоянии покоя и лишь только 10–30% — в цикле клеточного деления (S-фаза). Не исключено, что костномозговые клетки-супрессоры могут осуществлять и контроль за выходом стволовых клеток из покоящегося состояния в фазу активного деления.

Таблица 14. Клетки–мишени B–супрессоров в костном мозгу

Условные обозначения: ККМ — клетки костного мозга, ЛПС — липополисахарид, МЛ — митоген лаконоса, АОК — антителообразующие клетки. КОЕ — колониеобразующие единицы (стволовые клетки).

Таким образом, костномозговые B–супрессоры ограничивают пролиферацию антигенстимулированных и митогенстимулированных T– и B–лимфоцитов в селёзенке и лимфатических узлах, B–лимфоцитов костного мозга, активированных поликлональными стимуляторами, а также пролиферацию стволовых клеток. Можно предположить, что в лимфоидной и кроветворной тканях функционирует специальная система «надзора» за уровнем пролиферативной активности клеток.

Действительно, какова общая биологическая значимость B–супрессоров, находящихся в костном мозгу и проявляющих супрессорное действие только при непосредственном контакте с активно пролиферирующими клетками? Нами было высказано предположение, что костномозговые клетки-супрессоры призваны «запрещать» иммуногенез в костном мозгу in situ [50, 70]. Известно, что в костном мозгу содержится большое количество иммунокомпетентных B–лимфоцитов, а также небольшое количество T–лимфоцитов, способных кооперировать с B–клетками при индукции иммунного ответа. При попадании Аг в организм часть его (достаточная для индукции ответа соответствующим клоном B–клеток) попадает с током крови в костный мозг. Однако иммунизация приводит к продукции АОК в селёзенке и в других лимфоидных тканях, но не в костном мозгу. Небольшое число АОК появляется в костном мозгу при повторных иммунизациях только за счёт миграции антителопродуцентов из селезёнки и лимфатических узлов. Иначе говоря, в костном мозгу в физиологических условиях не происходит дифференцировки B–предшественников в АОК. Более того, клетки костного мозга не продуцируют АТ в культуре in vitro даже при наличии специфических или неспецифических хелперных T–клеточных факторов. Эта неспособность к продукции АТ не связана с отсутствием в костном мозгу зрелых форм B–предшественников, так как их популяция, выделенная из суспензии костного мозга фракционированием в градиенте плотности фиколла, развивает иммунный ответ в культуре in vitro при добавлении хелперных T–клеток. Не исключено, что данный метод фракционирования клеток одновременно удаляет костномозговые супрессоры. Таким образом, гипотеза о том, что костномозговые B–супрессоры призваны предотвращать антигенную дифференцировку клонов B–лимфоцитов на территории костного мозга, не лишена оснований.

Вместе с тем, в свете описанных выше данных о том, что основной функцией костномозговых B–супрессоров является подавление пролиферации всех активно делящихся клеток в популяции клеток–мишеней (T– и B–лимфоциты селезёнки и лимфатических узлов, B–лимфоциты костного мозга, стволовые клетки), а не избирательное ингибирование иммуногенеза, можно допустить, что способность костномозговых супрессоров подавлять пролиферацию отражает их «естественную» функцию регуляторов пролиферации клеток–предшественниц в костном мозгу.

Таблица 15. Влияние бесклеточной жидкости из смешанных культур клеток костного мозга и селезёнки на пролиферацию клеток костного мозга

Условные обозначения: те же, что и в таблице 14.