Гены HLA и их продукты

Гены HLA класса I, которые иногда по традиции называют генами, кодирующими трансплантационные Аг, первоначально были подразделены на 3 локуса, называемые А, В и С. Однако, сегодня кроме генов этих локусов в класс I системы HLA включаются ещё 18 генов, 11 из которых являются псевдогенами, а 7 — ассоциированы с продуктами транскрипции [408, 532].

Расположение генов А, В и С на хромосоме следующее: ближний к центромере локус HLA–B, на 0, 2 сМ (1 сМ соответствует 1´ 10 пар оснований ДНК) в сторону теломеры расположен локусHLA–C и на 0, 8 сМ в сторону теломеры расположен локус HLA–A [328]. «Соседом» кластера генов HLA класса I является ген, относящийся к классу III — C2, расстояние до которого от HLA–Bсоставляет 0, 65 сМ. Всего же размер кластера генов HLA класса I составляет 1, 4´ 10 сМ.

Организация генов HLA класса I имеет высокую степень гомологии. В них содержится 8 экзонов (рис. 33). Первый экзон кодирует сигнальную последовательность; второй, третий и четвертый — домены a₁, a₂ и a₃, соответственно, молекулы HLA. Пятый экзон кодирует трансмембранный участок цепи, цитоплазматический участок кодируют экзоны 6 и 7. Третий нетранслируемый участок кодирует экзон 8 (3'UT).

Межэкзонные различия между генами локусов А, В и С состоят в том, что гены HLA–A и -В содержат втрое больше нуклеотидов (1080) в 5 экзоне по сравнению с генами локуса HLA–C.

В дополнение к «классическим» локусам HLA–A, -В и -С к первому классу относят также гены HLA–E, -F, -G (рис. 32). Гены локуса E локализованы между локусами HLA–C и -J, а кодируемые ими Аг экспрессируются на покоящихся (зрелых) периферических T–лимфоцитах и клетках карциномы человека [328]. Гены HLA–F и -G картированы в сторону от теломеры на расстоянии 80 сМ [328] (рис. 32).

Благодаря использованию метода ДНК–генотипирования с применением сиквенc–специфических олигонуклеотидов, в 1994 г. при сиквенсе ДНК генов HLA–E установлено 5 аллельных вариантов, хотя соответствующие белки ещё не выявлены [147]. Антигены, кодируемые генами HLA–F, также ещё не установлены.

Антигены, кодируемые локусом HLA–G, экспрессированы на клетках линии хориокарциномы, а также на мембране клеток при хроническом цитотрофобластозе [219]. Как будет показано ниже, их физиологическая функция связана с репродукцией. Именно в таком аспекте велись исследования Аг HLA–G по программе XIV Международного совещания по гистосовместимости (Сиэттл, 2003).

Методом PCR-RFLP был установлен аллельный полиморфизм генов HLA–G в экзонах 2 и 3 [446]. Всего к настоящему времени установлено 14 аллельных вариантов HLA–G. Следует отметить, что вопрос о степени полиморфизма у вышеописанных «неклассических» генов остаётся открытым, как остаётся открытым и вопрос о биологической функции их самих и их продуктов.

Несколько новых генов с необычной периодической структурой идентифицированы на расстоянии 250 kb от локуса HLA–A в центро-мерном направлении. Анализ нуклеотидных последовательностей этих генов показал, что они относятся к псевдогенам. В этом же субрегионе комплекса HLA идентифицирован экспрессирующий ген, обозначенный как CD12 (на рис. 32 не указан) и расположенный на расстоянии 50 kb от гена HLA–A. Кодируемый им белок по своей структуре отличается от классических Аг класса I [209].

К Аг HLA класса I относят также гены локуса MIC (MICA и MICB) [331]. Аббревиатура генов MIC происходит от MHC class I Chain–related genes. Эти гены локализуются на хромосоме 6 в непосредственной близости от локуса HLA–B [295]. Молекула MICA состоит из 383 АК–остатков и имеет молекулярную массу 43 кД. Антигены локуса MIC обладают способностью связывать пептиды и другие короткие лиганды. В настоящее время не ясно, являются ли MIC–Аг более древними, либо напротив — происходящими от классических Аг класса I [125]. При нуклеотидном сиквенсе установлено 17 аллельных вариантов генов MICA и MICB [331], в геноме MICA обнаружено 5 различных аллельных вариантов, полиморфных по микросателлитным участкам [408]. Установлена взаимосвязь между микросателлитным полиморфизмом гена MICA и болезнью Бехчета. Данная ассоциация оказалась более выраженной, чем известные ранее ассоциации болезни Бехчета с классическими HLA–Аг.

В последнее время обнаружено, что Аг MICA участвуют в активации взаимодействия молекулы TCR MHC в развитии опосредованной T–лимфоцитами цитотоксичности и активности NK, тем самым, в частности, играя роль в обеспечении противоракового иммунитета [130]. Таким образом, по-видимому, Аг MIC по своей физиологической значимости приближаются к таковой, установленной для классических Аг HLA класса I.

Молекулярно–генетический анализ позволяет разделить регион HLA класса II на отдельные локусы (рис. 32). Внутри локуса HLA–DR локализуются относительно неполиморфный ген a–цепи -DRA(2 аллельных варианта) и несколько генов b–цепи: -DRB1–DRB9. Из данных генов b–цепи экспрессируются -DRB1, -DRB3, -DRB4 и -DRB5. Показано, что количество генов -DRB на данной хромосоме зависит от DR-специфичности гаплотипа.

Внутри регионов HLA–DQ и -DP кодируются два гена a- и два гена b–цепи. Однако, экспрессированы только гены -DQA1, -DQB1 и -DPA1, -DPB1.

Следует отметить, что каждая HLA–молекула несет только одну антигенсвязывающую бороздку, которая, тем не менее должна обеспечить представление всего разнообразия пептидов. Это обеспечивается за счёт экстремально высокого уровня HLA–аллельного полиморфизма. Помимо этого, двум из локусов HLA класса II — HLA–DQ и HLA–DP присуща ещё одна особенность: продукты этих генов формируют различные функционально активные молекулы, в зависимости от cis-и trans-положения при ассоциации a- и b–цепей.

Для идентификации аллельных вариантов генов HLA Номенклатурный комитет ВОЗ ввел новую официальную номенклатуру для идентификации Аг HLA [147]. Естественно, что количество аллельных вариантов генов HLA значительно превосходит количество ранее известных соответствующих Аг HLA. Более того, в отношении ряда HLA–локусов обнаружены не только количественные, но и качественные отличия, поскольку серологическими или клеточно–опосредованными методами продукты ряда генов таких локусов не выявляются.

Для сопоставления возможностей выявления HLA–специфичностей на уровне Аг с таковыми на молекулярно–генетическом уровне приведена таблица 17. Действительно, из этой таблицы следует, что молекулярно–генетическое HLA–генотипирование не только позволяет идентифицировать почти на порядок большее количество HLA–специфичностей, по сравнению с серологическими и клеточно–опосредованными методами, но и идентифицировать новые гены как в классе I, так и в классе II. Помимо этого в классе II в локусах HLA–DQ и -DP идентифицируются аллельные варианты, определяемые полиморфизмом отдельных цепей, например, -DQA1 и -DQB1.

Таблица 17. Два уровня выявления HLA–полиморфизма

Условные обозначения: I* — белковый (серотипирование, клеточно–опосредованное типирование) II* — молекулярно–генетическое ДНК–генотипирование

На наш взгляд, целесообразно для понимания реализации физиологической роли системы HLA более подробно осветить вопрос о роли полиморфизма отдельных генов HLA в осуществлении иммунных функций. Так, гены локуса DR включают только один низкополиморфный регион, кодирующий a–цепь. Более того, до настоящего времени полиморфизм гена HLA–DRA установлен в отношении наличия серина или валина в положении 217 [221], свидетельствуя о наличии только 2-х его аллельных вариантов. Напротив, в высокополиморфном регионе HLA–B полиморфизм проявляется как на уровне экспрессирующих генов, так и псевдогенов. Наиболее полиморфным из генов HLA–DRB является ген HLA–DRB1, насчитывающий к настоящему времени более 300 аллельных вариантов.

Локус DQ комплекса HLA класса II содержит по 2 пары генов А и В (рис. 32), однако хотя гены -DQA2 и -DQB2 транскрибированы, их белковые продукты ещё не установлены, и поэтому в настоящее время принято считать, что единственными экспрессирующими генами локуса DQ являются -A1 и -В1. При этом, в отличие от локуса DR, полиморфизм локуса DQ связан с генами какHLA–DQA, так и HLA–DQB. Полиморфизм локуса DQ в значительной степени связан с полиморфизмом генов -DRB, причём эта связь значительно более выражена для генов -DQA, по сравненению с генами -DQB.

Третьим из «хорошо изученных» локусов HLA класса II является регион DP, в котором экспрессирующими являются также два гена — DPA1 и -DPB1, в то время как гены -DPA2 и -DPB2 являются псевдогенами [524]. Исследования сиквенса генов -DPA позволили установить к 1989 г. наличие 8 аллелей, в регионе -DPB1 было установлено 38 аллелей. Эти аллели идентифицируются методом SSO и для части из них установлено соответствие с определёнными Аг HLA–DP [146], выявленными в тесте примированной смешанной культуры лимфоцитов (PLT). Следует отметить, что для Аг локуса HLA–DP установлен значительно более низкий уровень полиморфизма (на уровне АК–последовательностей) по сравнению с генами локусов HLA–DR и -DQ.

Помимо «хорошо изученных» генов HLA класса II, в регионе HLA–D обнаружены «новые» гены HLA (рис. 32), среди них в первую очередь необходимо остановиться на генах HLA–DOB, HLA–DNA и, особенно, HLA– DM (-DMA и -DMB), -LMP и -TAP. Три последних локуса обеспечивают такую важнейшую функцию, как процессинг и экспрессию Аг HLA на поверхности клеток [180, 191]. Подробнее эти локусы будут описаны в разделе, посвященном изложению представлений о процессинге и экспрессии Аг HLA.

Гены HLA–DOB выявлены в ДНК-библиотеке, полученной из B–лимфобластных линий клеток, и при этом была установлена 70% нуклеотидная гомология с генами DRB, DQB и DPB. ГеныHLA–DOB картированы между локусами DQ и DP, их экспрессия установлена на уровне мРНК в B– и в T–клеточных линиях, стимулированных ИФНg [532].

Гены HLA–DNA были получены из геномной ДНК, гибридизованной с HLA–DRA и они открываются на уровне РНК, выделенной из B–клеточных линий [532]. Гены локализованы в непосредственной близости от генов HLA– DQB в сторону центромеры (рис. 32).

Гены HLA класса III расположены на хромосоме между генами HLA классов I и II (рис. 32). До последнего времени этот регион, по сравнению с генами класса I и II, был изучен слабо. Теперь же стало известно, что гены HLA класса III выполняют несколько важнейших биологических функций.

Так, одним из генов HLA класса III, привлекающих наибольшее внимание исследователей, работающих как в области изучения структуры системы HLA, так и в проблеме «HLA и болезни» является ген CYP21 (на рис. 32 не показан). Продуктом этого гена является Аг HLA–B42, но основная его функция — контроль активности фермента цитохрома Р450. Дефицит этого фермента приводит к развитию синдрома врождённой гиперплазии надпочечников, частота которого составляет в популяции европеоидов 1: 10 тыс. В норме функцию цитохрома Р450 определяет ген CYP21, в то время как CYP21A является псевдогеном. Известно также, что дефицит 21 гидроксилазы (21ОН) в 25% случаев обусловлен делецией не только гена CYP21B, но и гена С4В в результате генной конверсии [276].

Гены локуса C4 (С4А и С4В) кодируют 4 компонента комплемента. Продукт этого локуса — сывороточный белок C4 с мол. массой 200 кД синтезируется как молекула–предшественник, которая при созревании образует белок, состоящий из 3-х цепей: a, b и g, с мол. массой 756, 95 и 30 кД, соответственно. Компоненты комплемента C4a и C4b, кодируемые генами С4А и С4В, различаются как по физическим свойствам, так и по биологической эффективности. Так, компонент C4a в 100 раз эффективнее, по сравнению с компонентом C4b, связывает аминовые группы. Анализ нуклеотидной последовательности генов С4А и С4В позволил установить различия в последовательности 6 АК–остатков в a–цепи.

Исследование полиморфизма локуса C4 в различных популяциях представляет значительный интерес для проблемы «HLA и болезни». Так, в популяциях европеоидов наличие «С4А нулевого аллеля» в большинстве случаев ассоциировано с делецией сегмента региона HLA класса III, включающего гены С4А и CYP21A. Помимо этого, наличие «нулевого аллеля» в гаплотипе ассоциировано с предрасположенностью к СКВ и другим аутоиммунным патологиям. Следует отметить, что полное отсутствие локуса генов C4 (результат гомозиготности в обоих локусах) также имеет выраженную ассоциацию с СКВ. Что касается ассоциации СКВ и гаплотипа HLA в целом, то наиболее сильная связь с предрасположенностью к СКВ установлена для гаплотипа HLA–A1, -В8, -DR3, -C4.

Непосредственно к гену С4В примыкает (в сторону теломеры) блок генов G1–13 [512] (на рис. 32 не показан).

Недавно установленный ген G1, кодирующий полипептид, состоящий из 93 АК, характеризуется 35%-ной идентичностью с внутриклеточным Ca²⁺–связывающим белком кальмодулином [442] и, по-видимому, выполняет аналогичную кальмодулину функцию.

Ген G11 экспрессирован в моноцитах, макрофагах, T и B–лимфоцитах и клетках печени, кодирует белок с мол. массой 28 кД, но его функция не известна.

Ген G13 кодирует белок с мол. массой 77 кД [317], принимающий участие в процессах транскрипции HLA. Ген картирован на ближайшем к гену DRA конце региона HLA класса III.

Непосредственно к гену С4А примыкает ген Bf, продукт которого фактор В является компонентом альтернативного пути активации комплемента и структурно сходен с компонентом классического пути активации комплемента C2. Ген C2 расположен на расстоянии 0, 65 п.о. от локуса HLA–B.

Ген В (Bf) функционирует в значительной степени совместно с геном C2, принимая участие в «запуске» активации каскада комплемента, включая активацию компонентов комплемента C3 и C5, кодирующихся генами, находящимися вне системы HLA. Дефицит фактора В описан только в гетерозиготе [558]. В гомозиготе дефицит В фактора не описан и, по-видимому, является летальным. Как C2-, так и Bf-гeны — полиморфные. Наибольшая частота встречаемости из аллелей гена C2 — С2С. Наиболее частотными аллелями гена Bf являются F и S.

Между генами Bf и C4 локализуются два недавно открытых гена, обозначенных SK12W и DQM3Z (на рис. 32 не показаны).

Дефицит компонента C2 является наиболее частой формой недостаточности системы комплемента у человека (частота отсутствия компонента C2 в гомозиготе составляет 1: 10 тыс.). Следует отметить, что дефицит фактора C2 обнаружен у 40% больных СКВ [507]. Отсутствие компонента C2 связанно не с делецией участка ДНК, а с нарушением транскрипции мРНК [506].

На расстоянии 92 kb от гена C2 в сторону от центромеры находится локус генов теплового шока 70 (HSP70), состоящий из 2-х генов, входящих в семейство с мол. массой 70 кД. Нуклеотидный сиквенс двух генов локуса HSP70 — HSP01 и HSP02 свидетельствует о том, что они занимают участок в 12 kb и кодируют идентичные белковые продукты, состоящие из 641 АК–остатка [406]. Третий ген локуса HSP70 — HSP70-HOM локализован на расстоянии 4 kb в сторону теломеры от гена HSP01 и кодирует белок, содержащий 641 АК–остаток. Гомология между генами HSP01 иHSP70-HOM составляет 90%. Гены HSP01 и HSP02 экспрессируются на высоком уровне в организменных клетках при тепловом шоке при температуре 42 °C. Продукты локуса HSP70 играют определённую роль во внутриклеточном транспорте пептидов и вызывают развертывание белка перед преципитацией Аг [456]. Проведёнными исследованиями установлен полиморфизм гена HSP01 на уровне промоторного региона и гена HSP70-HOM — на уровне кодирующего участка [406].

Крайним в сторону теломеры среди генов HLA класса III является локус TNF, отстоящий на 600 кb от локуса HLA–B [533]. В локус входят 2 гена — TNFA, кодирующий белок из 156 АК, и TNFB, кодирующий белок, включающий 171 АК. Сиквенс генов локуса TNF свидетельствует о 35%-ной гомологии генов TNF, кодируемые ими белки соответствуют TNFa и TNFb. Оба белка секретируются активированными макрофагами и T–лимфоцитами и оказывают плеетропное действие на различные клеточные типы, включая различные субпопуляции лимфоцитов, нейтрофилы и эпителий сосудов [309]. Указанные механизмы действия белков TNF, а также их влияние на воспалительный процесс, опосредованный ими цитолитический и цитотоксический эффекты против раковых клеток, свидетельствуют о важнейшей биологической функции локуса TNF [465]. Помимо этого белки TNF участвуют в регуляции экспрессии Аг HLA класса I на эндотелии сосудов [352], что свидетельствует об участии продуктов локуса TNF в развитии аутоиммунных патологий и при развитии реакций отторжения трансплантата.

Гены HLA блока G (класса III относящиеся к группе G) распределены в регионе HLA класса III дискретно. И часть их (гены ВАТ) в настоящее время рассматривается как отдельный локус.

В регионе генов HLA класса III большое количество новых генов, причём экспрессирующих, выявлено при изучении структурной организации комплекса MHC человека в рамках программы международных рабочих совещаний по изучению HLA. К ним следует отнести гены ВАТ1–9 (B–ассоциированные транскриптеры). Авторы, открывшие эти гены, ссылаясь на данные литературы и на свои собственные результаты, не исключают возможности идентификации в этом регионе более чем 19 генов. К настоящему времени установлены белковые продукты двух генов, входящих в локус -ВАТ — ВАТ2 и ВАТ3. Это богатые пролином белки с мол. массой 228 и 110 кД, соответственно.

По-видимому, изучение биологической роли белков этих генов предполагает выполнение таких этапов, как отбор полноразмерных генов из кДНК-библиотеки, сиквенирование генов и их трансфекция, затем получение микробиальных продуцентов, синтезирующих полноразмерные белки, что, безусловно, требует достаточно много времени. Тем не менее, в ближайшее время можно ожидать опубликования материалов, определяющих биологическую значимость этих генов и кодируемых ими белковых продуктов, в том числе и в патогенезе заболеваний.

Безусловно, обнаружение новых генов как в составе комплекса MHC, так и во фланкирующих его фрагментах ДНК, имеет большую значимость. До сих пор не исключается возможность развития заболеваний человека, обусловленных нарушениями в структуре генов, локализованных рядом с генами главного комплекса гистосовместимости классов I и II, или функциональной активностью кодируемых этими генами белковых продуктов. Кандидатами на эту роль могут быть в первую очередь гены серии ВАТ. Вполне возможно, что их белковые продукты участвуют во внутриклеточном процессинге Аг, их транспорте и в других событиях, которые также выполняют молекулы MHC классов I, II и III. Но в то же время, это нисколько не противоречит данным, убедительно свидетельствующим о том, что АК–замены в полиморфных эпитопах молекул гистосовместимости класса II играют ключевую роль в нарушении физиологического иммунного гомеостаза и в запуске таких аутоиммунных заболеваний как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), псориаз и целиакия.