Главная страница Случайная страница
КАТЕГОРИИ:
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Транспортера Sut1p Pichia stipitis
|
|
Виконала:
студентка групи БЛБ-34
Устінова К.С.
База практики:
відділ молекулярної генетики та біотехнології
ІБК НАН України
Термін практики:
22 червня 2013р.- 19 липня 2013р.
Керівники практики:
від організації - к. б. н. Дмитрук К.В.
від кафедри – доц., к. б. н. Стасик О.Г.
Львів – 2013
Зміст:
1. Загальна інформація про організацію – базу проходження практики…....3
2. Інформація про функції, структуру та організацію роботи біохімічної лабораторії, її забезпечення реактивами, матеріалами та обладнання……….…..5
3. Опис виконання практики згідно з календарним планом………………....7
4. Вступ……………………………………………………………………….…8
5. Матеріали і методи дослідження
5.1.Об’єкт досліджень …………………………………..………….........…10
5. 2.Поживні середовища та умови культивування…………………..….10
5. 3. Методи дослідженнь
5. 3. 1. Електротрансформація дріжджів Hansenula polymorpha……....11
5. 3. 2. Полімеразна ланцюгова реакція ……………………...……..…12
5. 3. 3.Електрофорез ДНК в агарозному гелі ………………...……....13
5. 3. 4. Розщеплення ДНК ендонуклеазами рестрикції …….….….…14
5. 3. 5.Виділення плазмідної ДНК з клітин E. сoli …………….……… 14
6. Результати дослідження та їх обговорення………………………….…...16
7. Пропозиції кафедрі біохімії з покращення підготовки нас як спеціалістів………………………………………………………………………….20
Висновки…………………………………………………….………….…...…20
Література……………………………………………………………………...21
Особисті враження від практики………………………………………….....22
1. Загальна інформація про організацію – базу проходження практики
Інститут біології клітини НАН України створено в 2000 р. на базі Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. Відділення було організовано в 1969 р. Його керівниками були професор Степан Йосипович Кусень (1969-1995) і член-кореспондент НАН України Ростислав Степанович Стойка (1995-2000). Директором новоствореного Інституту став член-кореспондент НАН України Андрій Андрійович Сибірний.
Серед основних напрямків наукової роботи Інституту є вивчення молекулярно-генетичних і біохімічних механізмів гомеостазу органел, регуляції метаболізму у дріжджів та створення нових біотехнологічних процесів і продуктів на основі цих мікроорганізмів; дослідження молекулярних механізмів регуляції сигналізування, проліферації, диференціації та апоптозу у нормальних та пухлинних клітин тварин і людини.
Крім фундаментальних досліджень, Інститут проводить практично важливі розробки по створенню діагностичних препаратів (ензиматичних та імунологічних наборів, біосенсорів), розвиває напрямок гібридомної технології для отримання моноклональних антитіл, веде роботу по створенню генно-інженерних вакцин проти гепатиту В та імуно-тестів на маркерні білки злоякісних пухлин. Розпочато комплексні дослідження по розробці нового методу терапії деяких видів пухлин шляхом індукції їх голодування за аргініном. До розробок Інституту належать впроваджені у виробництво діагностичні набори " ДІАГЛЮК" та " АЛКОТЕСТ" для ферментативного визначення глюкози і алкоголю та імунореагенти для судової медицини і трансфузіології.
Інститут біології клітини НАН України складається із 4-х відділів: молекулярної генетики і біотехнології, регуляторних систем клітини, регуляції проліферації клітин, сигнальних механізмів клітини. В них працюють понад 100 співробітників, з них 2 члени-кореспонденти НАН України (А. А. Сибірний, Р. С. Стойка), 10 докторів (4 — по сумісництву) і 17 кандидатів наук. За 5 останніх років співробітниками Інституту опубліковано 5 монографій, 190 наукових статей, із яких 70 — у міжнародних виданнях, отримано 5 патентів України та 4 патенти європейського патентного відомства.
Інститут біології клітини є засновником Українського товариства клітинної біології, створеного в 2004 році.
Адреса Інституту: 14/16, вул. Драгоманова, Львів, 79005, Україна. Директор: Сибірний Андрій Андрійович, академік НАН України.
2. Інформація про функції, структуру та організацію роботи біохімічної лабораторії, її забезпечення реактивами, матеріалами та обладнаннями
Робота виконувалася в науково-дослідній лабораторії, що знаходиться у відділі молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України. Робоча кімната розташована на третьому поверсі приміщення Інституту і займає площу 25 кв.м. Стіни пофарбовані в світло-сірий колір і мають висоту 3, 8 м. Лабораторія обладнана водопровідною, газопровідною системами та електричною мережею 220В; оснащена лабораторними столами; підлога вкрита паркетним покриттям. В лабораторії наявне природне та штучне освітлення. Природне освітлення бокове, є одне вікно. В якості штучного освітлення використовують лампи денного світла. Мікроклімат в лабораторії характеризується відносною вологістю повітря 40%, температура повітря 18-20оС, швидкість руху повітря 0, 3 м/с, шум 45 дБ, що знаходиться в межах норми, вентиляція механічна, джерел пилоутворення немає. В лабораторії обладнано три робочих місця. Об'єм повітря на кожного працівника становить 23, 8м3. Крім робочої кімнати для роботи використовували культуральний бокс (3м2, одне вікно) обладнаний газопровідною системою.
Для здійснення дослідницької роботи використовувалося наступне обладнання: автоклав, центрифуга РС-6 (СРСР), мікроцентрифуга " Marathon micro А", “Еppendorf-5417R” (США), аналітична вага А-160 (США), вага ХЕ-510 (США), спектрометр “Helios Gamma UVG-100105”, термостат на 37°С (СРСР), пробірки, колби (100-500 мл), мірні циліндри (10-2000 мл), чашки Петрі, газовий пальник.
Перед початком роботи з приладами було пройдено інструктаж з техніки безпеки та ознайомлено з інструкцією по використанню кожного приладу.
Автоклав Необхідний для стерилізації посуду та поживних середовищ насиченою парою під тиском, вищим від атмосферного. В лабораторній роботі стерилізацію практикують як метод, що застосовується для знищення всіх форм життя як на поверхні, так і всередині об’єктів стерилізації. Оскільки автоклав – прилад, що працює при високому тиску та високій температурі, порушення правил його експлуатації може спричинити нещасні випадки. До роботи з автоклавом допускаються лише навчені особи.
Розрив автоклава – явище виняткове і небезпечне тим, що виникає вибухова хвиля, яка руйнує інші предмети. Вибух автоклава можливий за умови несправності манометра чи перегріву нижнього бака при нестачі в ньому води, чи закритого вентиля впуску пари в стерилізаційну камеру під час роботи.
Центрифуга Потрібна для відокремлення клітин мікроорганізмів від культуральної рідини. При недостатній ізоляції проводки та при відсутності заземлення може виникнути небезпека ураження електричним струмом. Винятковим явищем є розрив центрифуги, самовільне відкривання кришки приладу. Це може трапитися при незрівноваженні центрифуги.
Аналітична вага Призначена для зважування мікроскопічних кількостей реактивів. Небезпечним при користуванні аналітичними вагами є контакт тіла людини з частинами приладу, які можуть опинитися під напругою.
Спектрофотометр Прилад використовується для визначення оптичної густини досліджуваного зразка. Небезпека роботи на приладі полягає в недостатній ізоляції електропроводів та відсутності заземлення.
Кругова качалка (шейкер) Необхідна для культивування мікроорганізмів. Небезпечним при користуванні шейкером є контакт тіла людини з частинами приладу, які можуть опинитися під напругою.
Газовий пальник – небезпечний, коли погано відрегульований доступ кисню в пальник, при недостатній вентиляції і при контакті з легкозаймистими речовинами.
УФ-лампа – необхідна для стерилізації приміщень; УФ-промені шкідливо впливають на рогівку ока.
Також в роботі використовувався скляний посуд: мірні циліндри, пробірки та колби.
При необережному користуванні скляним посудом можливі випадки травматизму, особливо порізи і потрапляння шматочків скла в очі.
Всі прилади є заземлені і працюють від електромережі з напругою 220В, тому робота на них вимагає виконання відповідних правил техніки безпеки.
3. Опис виконання практики згідно з календарним планом
25.06-27.06 — створення календарного графіку роботи, проведення підготовки лабораторного посуду. Приготування поживних середовищ та буферів, необхідних для подальшої експериментальної роботи, нарощування штамів Hansenula polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1, ознайомлення із методикою виділення плазмідної ДНК Escherichia coli;
01.07-2.07 —електрофорез плазмід pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC в агарозному гелі та рестрикційний аналіз плазмід, приготування компетентних клітин для електротрансформіції;
3 .07-8.07 —електротрансформація штамів H. polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1 плазмідами pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, приготування поживних середовищ та лабораторного посуду для подальших експериментів;
9.07-12.07 — рестрикційний аналіз плазмід pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, електротрансформація штамів H. polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1 плазмідами pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC;
15.07-18.07 — перевірка наявності гена SUT1m в геномі отриманих рекомбінантних штамів за допомогою методу ПЛР.
19.07 — обрахунок отриманих результатів, оформлення звіту про проходження практики.
ВСТУП
Занепокоєння з приводу енергетичної безпеки, глобального постачання нафти і зміни клімату підвищили інтерес до виробництва рідкого біопалива з поновлюваних ресурсів. Етанол займає домінуюче положення серед поновлювального біопалива. Його використання обумовлено в основному високим рівнем його природного синтезу мікроорганізмами шляхом ферментації кукурудзяного крохмалю або цукрової тростини [4]. Найбільш оптимальним та перспективним є отримання біопаливного етанолу з поновлювальної та дешевої сировини, особливо з гідролізатів лігноцелюлозних відходів сільського господарства та деревообробної промисловості [6]. Найперспективнішими організмами для отримання етанолу з цукрів лігноцелюлози є дріжджі, зокрема термотолерантний вид Hansenula polymorpha [5].
Максимальна температура росту цього виду дріжджів становить 50 °С, що є абсолютним рекордом серед усіх дріжджів, і лише на 10 °С нижча максимальної температури росту відомих евкаріотичних організмів. Максимальна температура ферментації у H. рolymorpha (48 °С) має вперше уможливити проведення SSF процесу, тобто одночасної сахарифікації і ферментації глюкози та ксилози, оскільки ця температура близька до оптимальної для дії целюлаз і геміцелюлаз. [1]
Однак продуктивність процесу зброджування ксилози усіма відомими природними і лабораторними штамами мікроорганізмів є недостатньою для налагодження промислового виробництва. Таким чином, одержання дріжджових штамів з підвищеною продуктивністю алкогольної ферментації ксилози є важливим завданням, оскільки налагодження рентабельної технології отримання паливного етанолу з рослинної біомаси є головною передумовою для вирішення енергетичної, а також екологічної проблем у глобальному масштабі [3].
Завдяки попереднім дослідженням, проведеним в Інституті біології клітини НАН України, було сконструйовано глюкозно/ксилозний транспортер Sut1p Pichia stipitis із зміненими кінетичними властивостями. Ці зміни полягають в тому, що даний модифікований транспортер має або підвищену афінність до ксилози або знижену афінність до глюкози. Для того, щоб це перевірити було поставлене завдання, яке полягало у тому, щоб трансформувати штами H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 двома плазмідами, що містять ген SUT1m. Плазміда pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC містить ген SUT1 під конститутивним промотором Gap, плазміда pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC містить ген SUT1 під регульованим промотором Met25.
Завданнями наших досліджень були:
1) Перевірка коректності структури даних плазмід за допомогою рестрикційного аналізу
2) Електротрансформація штамів H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 даними плазмідами
3) Перевірка наявності гена SUT1m в геномі отриманих рекомбінантних штамів за допомогою методу ПЛР
5. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
5. 1. Об’єкт досліджень
У роботі були використані такі штами
дріжджів Hansenula polymorpha
• NCYC495 leu1-1
бактерій Escherichia coli
• штам DH5a (fhuA2 Δ (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ 80 Δ (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17).
5.2. Поживні середовища та умови культивування
Клітини дріжджів та бактерій вирощували у пробірках об’ємом 20 мл, що містили 3 мл середовища, колбах на 500 мл, що містили 100 мл середовища на круговій качалці, та на чашках Петрі з 25 мл агаризованого середовища в термостаті при 370С для бактерій та 300С для дріжджів. Підрощували культури на круговій качалці (220 об/хв) при 370С (E. сoli) та 300С (S. сerevisiae).
В експериментах були використані середовища такого складу:
· YNB min, г/л:
§ YNB (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and amonium sulfate) – 1, 7
§ (NH4)2SO4 – 5
§ Глюкоза – 20
При вирощуванні штамів, ауксотрофних по лейцину, гістидину, триптофану, в середовище додавали згадані фактори росту у концентрації 40 мг/л.
· YPM, г/л:
§ Дріжджовий екстракт (YЕ) – 10;
§ Пептон – 10;
§ Мальтоза – 20.
· LB (Лурія-Бертрані), г/л:
§ Пептон – 15;
§ NaCl – 10;
§ YE – 5.
рН 7, 0 доводили 10 Н NaОН з розрахунку 50 мкл/100 мл для рідкого і агаризованого середовища. Концентрація джерел вуглецю становила 2% (ваговий або об’ємний), якщо не вказано інакше. Агаризовані середовища містили агар (1, 5%).
Для селекції бактерій використовували ампіцилін та зеоцин у концентрації 100 та 25 мкг/мл, відповідно. Селекцію дріжджових трансформантів здійснювали додаванням у середовище зеоцину у концентрації 150 мкг/мл.
Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD600) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій шляхом фотометрування на спектрофотометрі «Helios-λ» при довжині 600 нм у кюветі шириною 1 см.
5.3. Методи досліджень.
5. 3. 1. Електротрансформація дріжджів Hansenula polymorpha
Метод базується на здатності дріжджових клітин під впливом електричного імпульсу поглинати екзогенну ДНК.
Реактиви:
розчин 25 мМDTT у 50мМ калій-фосфатному буфері (рН 7, 5)
STMбуфер: 270 мМ сахароза;
10 мМTris-HCl (pH 7, 5);
1 мМMgCl2.
1. Нічну культуру H. polymorpha, вирощену у середовищі YPD при 370С, переносили у свіже середовище YPD (100 мл) та вирощували до оптичної густини ОD590= 1, 2-1, 5 (9х107 кл/мл);
2. Клітини осаджували центрифугуванням при 3000 об/хвпротягом 10 хв, ресуспендували у 0, 2 об’єму (20 мл) фосфатного буферу з дитіотреітолом (DТТ) та інкубували 15-20хв при 370С;
3. Далі клітини двічі промивали у охолодженому до 00С STMбуфері – спочатку в 1 об’ємі (100 мл), а потім у 0, 5 об’єму (50 мл) буферу; клітини ресуспендували у 0, 005 об’єму (500 мкл) STM (00С), щоб досягнути 2х1010 кл/мл; для довготривалого зберігання компетентних клітин аліквоти з 60 мкл клітинної суспензії у STMбуфері заморожували і зберігали при - 700С;
4. До 60 мкл суспензії клітин додавали ДНК і цю суміш переносили на дно попередньо охолодженої електропораційної кювети та піддавали дії електричного імпульсу (R = 129 Ом, C = 50 мкФ, U = 1, 5 кВ/см,) тривалістю ≈ 5мс та відразу додавали до суміші клітини/ДНК
1 мл середовища YPD кімнатної температури, акуратно перемішували, переносили в еппендорф та інкубували протягом 1 години при 370С.
5. Клітини осаджували центрифугуванням (5хв, 3000об/хв), отриману суспензію розсівали на чашки з селективним середовищем YPD з додаванням антибіотика або після промиванняdH2O (2 рази) на чашки з мінімальним середовищем та інкубували при 370С.
5. 3. 2. Полімеразна ланцюгова реакція
ПЛР використовується для ампліфікації сегменту ДНК, який знаходиться між двома відомими послідовностями. Два олігонуклеотиди використовуються як праймери для серії синтетичних реакцій, що каталізуються ДНК-полімеразою. ПЛР здійснювали на ампліфікаторі Gene Amp© PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). Загальний об’єм реакційної суміші становив 50 мкл для препаративної ампліфікації фрагментів або 10 мкл для аналітичної реакції.
Склад реакційної суміші для препаративної ПЛР: матриця – 0, 1мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 5 мкл (100 мкмоль), буфер 10× - 5 мкл, відповідні праймери – по 5 мкл, Taq ДНК полімераза – 0, 5 мкл (1 U, Fermentas), деіонізована вода - до об’єму 50 мкл.
Для аналітичної реакції: матриця – 0, 01мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 1 мкл, буфер 10× - 1 мкл, відповідні праймери – по 1 мкл, Taq ДНК полімераза – 0, 2 мкл, деіонізована вода - до об’єму 10 мкл.
Температура приєднання праймерів (аннілінг) – визначалася специфічно для кожної пари праймерів.
Використані праймери:
| Назва праймера | Нуклеотидна послідовність праймера |
| Ko653 | AAA GCGGCCGC atgtcttctcaagatattcc |
| Ko678 | AAA GCGGCCGC ttaaacatgttcgtcaacag |
5. 3. 3. Електрофорез ДНК в агарозному гелі
Принцип методу: метод базується на здатності негативно зарядженої молекули ДНК рухатися в електричному полі від катода до анода, що дає можливість розділяти та ідентифікувати фрагменти ДНК.
Реактиви:
§ агароза
§ TAE буфер:
§ 0, 04 М тріс-ацетат
§ 0, 002 М ЕДТА
§ буфер для нанесення проб:
§ 0, 1% бромфеноловий синій
§ 0, 5% ДСН
§ 0, 1М ЕДТА(pH 8.0)
§ 50 % гліцерол
Хід роботи:
Агарозу вносять в TAE буфер, нагрівають до повного розчинення і кип'ятять протягом 3 хв. Коли розчин охолоджується до 50оC, додають бромистий етидій. Охолоджений розчин заливають у кювету з гребінцем для формування лунок. Необхідно, щоб між дном кювети і гребінцем залишався шар агарози товщиною 0, 5-1 мм. Після полімеризації гелю гребінець видаляють, а кювету з гелем поміщають в електрофоретичну камеру з ТАЕ буфером. В лунки вносять виділену ДНК (0, 2-0, 5 мкг), змішану з буфером для нанесення проб так, щоб об'єм буферу становив 1/6 об'єму кінцевої суміші. Електрофорез проводять при напрузі 2-4 В/см2 протягом 30-40 хв. Зони ДНК реєструють, освітлюючи гель ультрафіолетовими променями. Одержану електрофореграму фотографують.
5. 3. 4. Розщеплення ДНК ендонуклеазами рестрикції
Метод базується на здатності ендонуклеаз рестрикції ІІ класу гідролізувати ДНК в певних сайтах (послідовностях нуклеотидів). В роботі використовували ферменти та відповідні інкубаційні буфери виробництва фірми “Fermentas” (Литва).
У реакційну суміш вносили 0, 5-2 мкг аналізованої ДНК в ТЕ-буфері чи бідистильованій воді. До розчину ДНК додавали 1/10 об’єму відповідного буферу і 1 од.акт. ферменту на 1мкг плазмідної ДНК, реакційну суміш доводили водою до відповідного об’эму. Суміш інкубували при 37оС 1-2 години.
5. 3. 5. Виділення плазмідної ДНК з клітин E. сoli
Реактиви:
· розчин І:
§ 50 мМ глюкоза,
§ 25 мМ Tris-HCl (pH 8.0),
§ 10 мМ ЕДТА (pH8.0),
· розчин ІІ:
§ 0, 2 М NaOH,
§ 1% SDS.
· 5М Калій ацетат,
· 3М Натрій ацетат,
· 7, 5М Амоній ацетат,
· фенол (pH 8.0),
· ізопропанол,
· 96% спирт,
· 70% спирт.
Хід роботи:
Бактерійні трансформанти нарощують в 100 мл селективного середовища протягом ночі. Біомасу осаджують центрифугуванням при 4000 об/хв. протягом 15 хв. Клітини промивають розчином І і центрифугують при 4000 об/хв. 12 хв. Супернатант зливають, а осад ресуспендовують в 2 мл розчину І. Після цього до суміші додають 4 мл розчину ІІ, перемішують поки суспензія не стане в’язкою. Потім додають 3 мл 5М ацетату калію, перемішують і центрифугують при 5000 об/хв. 15 хв, супернатант переносять в чисту пробірку і додають 0, 6 об’єму ізопропанолу. ДНК осаджують центрифугуванням при 4000 об/хв. 15 хв. Осад розчиняють в 200 мкл води. Для остаточної депротеїнізації до розчину додають 200 мкл фенолу, центрифугують при 12000 об/хв і відбирають верхню (водну) фазу. Додають 1/10 об’єму ацетату натрію, 2, 5 об’єми етанолу. Потім центрифугують 10 хв при 12000 об/хв. Осад (плазмідна ДНК) промивають 70% етанолом, підсушують і розчиняють в воді або ТЕ-буфері.
6. Результати дослідження та їхнє обговорення
Однією з лімітуючи ланок для досягнення ефективної алкогольної ферментації ксилози є проникнення цього субстрату в дріжджову клітину Відомо, що транспорт ксилози здійснюється транспортерами глюкози, проте з низькою ефективністю. Специфічні транспортери ксилози не ідентифіковані. Відповідно, створення транспортера з підвищеною афінністю до ксилози могло би вирішити одну з проблем ефективної ферментації ксилози промисловими штамами дріжджів [2].
Для досягнення поставленої мети було застосовано позитивну систему селекції для отримання транспортерів із заданими властивостями. Селекція базувалась на використанні штаму Δ hxt0 (MATa Δ hxt1-17 Δ gal2 Δ stl1 Δ agt1 Δ mph2 Δ mph3) S. сerevisiae у якого делетовано всі 20 відомих транспортерів гексоз. Гени ідентифікованих транспортерів гексоз H. polymorpha, а також транспортерів гексоз інших організмів (дріжджі C. intermedia, P. stipitis та рослина A. thaliana) було введено в геном вище зазначеного штаму S. сerevisiae. Ріст сконструйованих штамів був перевірений на середовищі з глюкозою. Було перевірено інгібуючий вплив ксилози при рості на глюкозі. Дріжджі S. сerevisiae нездатні утилізувати ксилозу, тому додавання цієї пентози обмежувало поглинання глюкози. Штами, в яких ксилоза найбільш ефективно інгібувала ріст на середовищі з глюкозою були використані для подальших експериментів.
Відібрані штами культивувались на альтернативному субстраті – гліцерині, що має окрему систему транспорту. Було підібрано мінімальну токсичну концентрацію токсичного аналога глюкози – 2-дезоксиглюкози, що інгібує ріст трансформантів на середовищі з гліцерином. Ксилоза відновлювала ріст рекомбінантних штамів шляхом обмеження проникнення 2-дезоксиглюкози в клітину. Використовуючи описану позитивну селекцію, були ізольовані мутантні штами, що формували колонії на нижчій концентрації ксилози. Ріст таких мутантів був обумовлений збільшенням спорідненості транспортера до ксилози або зниженням спорідненості до 2-дезоксиглюкози або глюкози. Далі було визначено нуклеотидні послідовності модифікованих транспортерів.
У модифікованому транспортері SUT1m виникла точкова мутація, яка призвела до змін в білковій структурі – заміна амінокислоти метіоніну на валін.
Модифікований транспортер SUT1m має або підвищену афінність до ксилози або знижену афінність до глюкози. Для того, щоб це перевірити, було поставлене завдання, яке полягало у тому, щоб трансформувати штами H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 двома плазмідами, які містять ген SUT1m.
В роботі було використано дві плазміди: pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC (рис.1.)
Рис.1. Лінійна схема інтегративної плазміди pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, що містить відкриту рамку трансляції гена SUT1 P. stipitis під контролем конститутивного промотора Gap та термінатора Gap, а також селективний маркер ген стійкості до норзеотрицину NTC.
Рис.2. Лінійна схема інтегративної плазміди pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC, що містить відкриту рамку трансляції гена SUT1 P. stipitis під контролем регульованого промотора Met25 та термінатора Gap, а також селективний маркер ген стійкості до норзеотрицину NTC.
Коректність будови даних плазмід була перевірена за допомогою рестрикційного аналізу (Рис 3).
|
|
Рис.3. Визначеня коректності структури плазмід pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC методом рестрикційного аналізу.
1 - pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC оброблена ScaI (очікуваний результат: 6514 т.п.н.); 2 – BamHI: 1517, 4997 т.п.н.; 3 – NotI: 1670, 4844 т.п.н.; 5 – SalI: 2061, 4453 т.п.н.; 6 – XbaI: 665, 5849 т.п.н.; 7 – BglI: 889, 4079, 1546 т.п.н.; 4, 8 - маркер молекулярної ваги; 9 - pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC оброблена ScaI: 6476 т.п.н.; 10 – BamHI: 1470, 5006 т.п.н.; 11 – NotI: 1670, 4806 т.п.н.; 12 - маркер молекулярної ваги.
За допомогою методу електропорації дріжджів були отримані трансформанти H. polymorpha, що містили ген SUT1. Перед трансформацією плаздміди були лінеаризовані ендонуклеазою рестрикції SсaI. Для визначення ефективності трансформації також використовували кільцеву плазміду pGlG.
Відбір трансформантів здійснювали, висіваючи клітини після трансформації на середовище YPD з додаванням антибіотику NTC (норзеотрицин) у концентрації 100мкг/100мл. Одержано велику кількість дрібних колоній, які характеризувалися дуже повільним ростом. У якості негативного контролю використовували клітини, які піддавались дії електричного імпульсу без внесення плазмідної ДНК.
7. ПРОПОЗИЦІЇ КАФЕДРІ БІОХІМІЇ З ПОКРАЩАННЯ ПІДГОТОВКИ НАС ЯК СПЕЦІАЛІСТІВ
На мою думку, для покращення підготовки нас як спеціалістів необхідно збільшити кількість практичних і лабораторних робіт, що дозволить студентам більше орієнтуватись в сучасних методичних підходах.