Определение содержания витаминов В1, В2 методом ВЭЖХ в премиксах.

Цель занятия: ознакомление с методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и определении количественного содержания витаминов В1, В2 в премиксах.

Материалы и оборудование

1. Жидкостной хроматограф с насосом Waters 1525 EF и спектрометрическим детектором Waters 2487

2. Хроматографическая колонке Symmetry 300^тм C 18. 5 мкм, 3, 9× 150 мм.

3. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0, 1 мг.

4. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц.

5. Центрифуга RotoFix 32A

5. Основной стандартный раствор витамина В1 с концентрацией 1 мг/мл.

6. Основной стандартный раствор витамина В2 с концентрацией 0, 05 мг/мл.

7. Раствор хлористоводородной кислоты молярной кон­центрации 0, 01 моль/мл.

8. Одноразовые фильтры с размером пор 0, 45 мкм диаметром 13 мм.

Приготовление раствора хлористоводородной кислоты с концентрацией 0, 01моль/мл.

К 1 л дистиллированной воды прибавляют 0, 8 мл концентрированной (37 %) хлористоводородной кислоты и доводят рН раствора до 2 + 0, 2.

Приготовление рабочего стандартного раствора

витаминов В1 и В2

Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В1 и В2 6еpyт навески 0, 1 г тиамина хлорида и 0, 01 г рибофлавина. Навеску тиамина хлорида растворяют в дистиллированной воде мерной колбе вместимостью |100 мл, а рибофлавина в мерной колбе вместимостью 200 мл, при нагревании до температуры 70—80 " С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 мл 1 мг витамина В1 и 0, 05 мг витамина В2 соответ­ственно.

Срок хранения основных стандартных растворов витаминов В1 и В2 — не более 2 недель в холодильнике.

Контроль за содержанием витаминов В1 и В2 в основных стан­дартных растворах

Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям мо­лярных коэффициентов светопоглощения.

Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистилли­рованной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность раство­ров на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя I см.

Массовую концентрацию витаминов В1 и В2 (С) рассчитывают по формуле (1)

,

(1)

где D — оптическая плотность;

Е— молярный коэффициент;

l— толщина слоя раствора, 1. см.

Массовую концентрацию витаминов В1(С1) и В2 (С2), мг/мл, рассчи­тывают соответственно по формулам (2) и (3):

(2)

(3)

Где, 205- молярный коэффициент светопоглощения тиамина хлорида при рабочей длине волны 268 нм;

324- молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм;

Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов

В1 и В2

Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов В1 — 0, 02 мг и В2 — 0, 025 мг в 1 мл.

Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см' помещают 1 мл основною стандартного раствора тиамина хлорида и 25 мл основ­ного стандартного раствора рибофлавина, доводят до метки ди­стиллированной водой и перемешивают.

Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.

П р о в е д е и и е и с п ы т а и и я

Экстракция витаминов В1, и В2,

Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не бо­лее 0, 0005 г. помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл и приливают 10 мл раствора соляной кислоты молярной кон­центрации с (НСI) — 0, 01 моль/мл. Колбу ставят на магнитную ме­шалку с включением нагрева80°С. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифуж­ную пробирку и центрифугируют при 5000— 6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 мл. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 мл) раствора хлористоводородной кислоты молярной кон­центрации 0, 01 моль/мл, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют, Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3—4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0, 45 мкм и используют для хроматографического анализа.

Хроматографирование.

Хроматографирование осуществляют в следующих условиях:

– разделение проводят на колонке Symmetry 300 C 18. 5 мкм, длиной 3, 9 мм*150 мм.

– подвижная фаза – элюэнт, состоящий из 120 мл ацетонитрила, 800 мл воды бидистиллята, 2, 5 мл триэтиламина, 0, 5 г октансульфоната натрия, рН раствора 7, 6, доводится ортофосфорной кислотой.

– рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм.

– скорость элюирования 1, 2 мл/мин

– вpем|я элюирования для витамина В1 составляет 2, 5 мин, а для витамина В2 2, 9 мин

– объем загрузки анализируемого раствора 20 мкл.

Для насыщения колонки в начале работы производится 3—5 загрузок, отмечая площади пиков. При достижении постоянной площади пика можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографнруют каж­дый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов В1 и В2.

Обработка р е з у л ь т а т о в и с п ы т а н и я

Содержание витаминов В1 и В2 Х1, и Х2 в премиксе, мг/кг, вычисляют по формуле

(4)

где S — площадь пика витамина на хроматограммах экстракта из

премикса;

с — массовая концентрация витамина в рабочем стандартном ра­створе, мг/мл;

V — объем премикса с экстрактом, мл;

S_ст — площадь пика витамина на хроматограммах рабочего стан­дартного раствора;

m— масса навески премикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхожде­ния между которыми при доверительной вероятности Р = 0, 95 не дол­жны быть более 10 % относительно среднего арифметического значе­ния, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0, 95 не дол­жны быть более 15 %