Студопедия

Главная страница Случайная страница

КАТЕГОРИИ:

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Основы ионообменного метода






 

В ионообменной хроматографии метод основан на притяжении противоположно заряженных частиц, где неподвижная твердая фаза обычно состоит из сорбента («смолы») с ковалентно связанными анионами или катионами. Противоположно заряженные ионы растворенного вещества в жидкой, подвижной фазе электростатическими силами притягиваются к ионам сорбента. Адсорбированные компоненты образ­ца затем элюируют с применением солевого градиента, который постепенно десорбирует молекулы образца в порядке увеличения электростатического взаимодействия, с ионами в колонке

Ионообменная хроматография характерна высоким разрешением, большой емкостью и не заменима при разделении высокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким соединениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара. нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды и другие заряженные молекулы.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче. Также ее используют для анализа ядохимикатов в пищевом сырье, для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии проводят за 20–40 мин с лучшим разделением.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы.

В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.
Существует два типа ионообменников – катионообменники и анионообменники. Катионообменники содержат отрицательно заряженные группы и притягивают положительно заряженные частицы – катионы. Такие

ионообменники называют также кислотными ионообменниками, поскольку их отрицательный заряд возникает в результате ионизации групп с кислотными свойствами. Анионообменники содержат положительно заряженные группы, которые притягивают отрицательно заряженные частицы – анионы. По аналогии, для них применяется термин основные ионообменники, поскольку их положительный заряд обычно является результатом присоединения протона к основным группам.

Механизм ионного обмена принято рассматривать из следующих этапов:

диффузия иона к поверхности ионообменника (в гомогенных растворах происходит быстро)

● диффузия иона сквозь матрицу ионообменника к участку обмена (зависит от количества перекрестных сшивок в матрице и концентрации раствора). Считается, что данная стадия определяет скорость ионного обмена в целом.

● Обмен ионов происходит мгновенно ипредставляет собой равновесный процесс.

Катионообменник

Смола – (SO3 )… H+ + Na+ ↔ Смола – (SO3 )… Na+ + H+

Анионообменник

Смола–N+ … CI + OOC ↔ Смола–N+OOC + CI

Чем больше заряд на обмениваемой молекуле, тем прочнее она связывается с ионообменником и тем труднее ее вытеснить другими ионами.

Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным

зарядом, взаимодействующие с катионами.

В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака, т.е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, дозволяющими регулировать значение рН.
При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами ионообменника. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы.

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо удерживаться на колонке и первыми вымываются с нее и, наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюировать из колонки последними. Обычно возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей образца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» виде, и поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпирических, а не теоретических закономерностей при ионообменной хроматографии.

Среди матриц можно назвать полистирол, целлюлозу, агарозу.

Функциональные ионизируемые группы сульфонатная (–SO3) и четвертичная аммонийная (–N+R3) – сильные ионообменники, поскольку они полностью ионизированы при стандартных рабочих значениях РН; карбоксильная (– СОО)группа и диэтиламмоний (–НN+ (CH2 CH3)2) слабые ионообменники, поскольку они ионизированы лишь в узком диапазоне Рн.

Примеры наиболее часто используюмых ионообменников представлены в таблице 2.5.1

Таблица 2.5.1

Свойства некоторых важных ионообменников

Функциональная группа Типы ионообменника Интервал рН
\ –N+ – СН3 /     Четвертичный амин (сильный анион)   1-11
–NH2 Первичный амин (слабый анион) 1-8
\ NH /   Вторичный амин (слабый анион)   1-7
\ – N /   Третичный амин (слабый анион)   1-6
– СОО Угольная кислота (слабый катион) 6-14
– SO3 Сульфокислота (сильный катион) 1—14

 

Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола и дивинилбензола. Обычно добавляют 8–12% последнего. Чем больше содержание дивинилбензола, тем больше жесткость и прочность полимера, выше емкость и, как правило, селективность и тем меньше набухаемость. Диаметр частиц таких сорбентов составляет от 5 до 25 мкм. Большинство ионообменников для ВЭЖХ стабильны до 60 °С., так, что разделение можно осуществлять при этой температуре: с ростом температуры падает вязкость подвижной фазы и следовательно, увеличивается эффективность разделения. Некоторые полимерные катионообменники выдерживают температуру и даже до 80 °С.


2.5.2 Выбор подвижной фазы и условий разделения.

Ионообменное, разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства. Иногда добавляют в ПФ небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей – метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и

концентрации добавленных органических растворителей.

Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения образца между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. анионного или катионного обмена), причем последний процесс доминирует.
Сила электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника влияет на распределение вещества между фазами. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут

взаимодействовать с материалом матрицы неспецифически.

Степень удерживания образца снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора обычно находится от 0, 001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя – самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать, так как возможно выпадение осадка и забивание колонок.
В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды.

Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4 °С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20–30 °С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению k' для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению.
Вводимые количества образца не должны превышать 5 % суммарной ионообменной емкости. Так, для соединений с молекулярной массой 200–500 предполагается введение около 50 мг пробы на 1 г полимерного сорбента.

Желательно, чтобы вводимый объем образца не превышал 1/3 объема

первого интересующего пика.

 


Поделиться с друзьями:

mylektsii.su - Мои Лекции - 2015-2024 год. (0.008 сек.)Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав Пожаловаться на материал