Проведение испытания

Цель занятия: ознакомление с ионообменным методом ВЭЖХ определения количественного содержания и состава углеводов в медах с использованием метода внешнего стандарта или абсолютной калибровки

Сущность метода.

Сущность метода заключается в извлечении углеводов из навески меда водой и определении их состава и количественного содержания на жидкостном хроматографе с рефрактометрическим детектором методом ионообменного элюирования с использованием калибровочного графика стандартов.

Материалы и оборудование.

1. Хроматограф жидкостной с насосом Waters 1525 EF и рефрактометрическим детектором Waters 2414 с диапазоном измерения по коэффициенту рефракции 1-1, 75 RIU

2. Колонка хроматографическая стальная Sugar –Pak, размером 6.5× 300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме.

3. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц.

4. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0, 1 мг.

5. Фильтры с размером пор 0, 45 мкм, диаметром 13 мм.

6. Элюент 0, 0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.

7. Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч. по Гост 975-88.

8. Фруктоза кристаллическая, х.ч.имп.

9. Вода деионизованная с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.

Построение градуировочных графиков для стандартов глюкозы и фруктозы.

(1, 0 + 0, 0005) г стандартного образца препарата глюкозы растворяют в деионизованной воде в колбе вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Получают основной стандартный раствор глюкозы с содержанием 10 мг/мл.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 1 мг; 5 мг; 10мг; 15мг; 20 мг глюкозы в 100 мл соответственно. Для этого берут соответственно 0, 1; 0, 5; 1, 0; 1, 5; 2, 0 мл основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают.

Аналогичным образом готовят рабочие стандартные растворы для препарата фруктозы.

Растворы пригодны в день приготовления.

Рабочие стандартные растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

– хроматографическая колонка стальная Sugar–Pak, размером 6, 5× 300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме;

– подвижная фаза 0, 0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см;

– объем пробы 20 мкл;

– скорость подачи элюента 0, 5 мл/мин;

– температура хроматографической колонки 80°С;

– температура детектора 50°С;

Время выхода хроматографического пика глюкозы составляет 9, 5 мин, фруктозы 11, 4 мин.

Каждый раствор хроматографируют по 2 раза и строят калибровочные графики для глюкозы и фруктозы соответственно, откладывая по оси ординат значения площадей хроматографических пиков, по оси абсцисс – значения содержания глюкозы или фруктозы в мг в 100 мл раствора.

Проверка градуировочных графиков.

Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора стандартов глюкозы и фруктозы хроматографируют при выше указанных условиях. Отклонения полученных результатов (площадь хроматографических пиков) от измеренных в момент построения градуировочного графика, А %, определяют по формуле (1)

(1)

где, S₁ и S₂ –площади хроматографических пиков, определенные при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно.

При отклонении результатов более, чем на 5 %, строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам препарата глюкозы и фруктозы.

Проведение анализа

Навеску меда массой 1 г, взвешенную с погрешностью не бо­лее 0, 0005 г, помещают в стаканчик вместимостью 100 мл, приливают 50 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают.

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0, 45 мкм и используют для хроматографирования.

Подготовку проб проводят в двух параллелях.

Хроматографирование

Полученные испытуемые растворы хроматографируют по 2 раза. На хроматограммах испытуемых растворов находят площади хроматографических пиков сахаров глюкозы и фруктозы, рассчитывают среднее значение площадей и по градуировочномым графикам определяют содержание соответствующих сахаров в 100 мл в мг.

Хроматографирование испытуемых растворов осуществляют в тех же условиях, что и стандартные растворы, при построении калибровочных графиков.

Обработка результатов испытания.

Содержание сахаров глюкозы (Х₁) и фруктозы (Х₂) в испытуемых образцах в мг/г определяют по формуле (2):

;

(2)

Где, С₁ (С₂) –содержание сахаров глюкозы и фруктозы в 100 мл, найденное по калибровочным графикам, в мг соответственно,;

m- масса навески меда, г;

100- разведение

Результат определения вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми при доверительной вероятности Р=0, 95 не должно быть более 10 % относительно среднего арифметического значе­ния.

Список рекомендуемой литературы

1. ФСП 42-0119-0445 00 Пиридоксин раствор для инъекций 50 мг/мл.

2. ГОСТ Р 53773-2010 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.

3. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище Р 4.1.1672-03.

4. Методика копании Waters по разделению моносахаров методом ионообменной хроматографии с помощью колонки Waters Sugar-Pak I.

5. Гост Р 50929-96 Приемиксы. Методы определения витаминов группы В.

6. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. Мир биологии и медицины. Перевод с анг. Хромова-Борисова Н.Н.. М. Техносфера. 2005г.– 254 с.

7. Стыскин Е.Л., Ициксон Е.Б., Брауде Е.Б. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография, М., 1988 г–284 с.

8. Уильсон К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. Пер. с англ. –М; Бином. Лаборатория знаний, 2013.–848 с.: ил., [4] с. цв. Вкл. – (Методы в биологии).