Хімічний склад нуклеїнових кислот

Молекули нуклеїнових кислот складаються з атомів азоту (15–16 %), фосфору (8–10 %), вуглецю, кисню і водню. З метою ідентифікації компонентів, що входять до складу НК, і їхнього кількісного визначення ДНК і РНК піддають ферментному або, найчастіше, кислотному гідролізу, у результаті чого виявляють пуринові (у молекулі пурину шестичленне кільце піримідину і п’ятичленний гетероцикл імідазолу знаходяться в конденсованому стані, утворюючи біциклічне похідне) (аденін і гуанін) і піримідинові (тимін, цитозин і урацил) азотисті основи, моноцукри — пентози (рибозу і дезоксирибозу) та фосфорну кислоту. При ферментному гідролізі НК утворюються продукти, що складаються із залишків азотистих основ, рибозного чи дезоксирибозного компонентів та фосфорної кислоти.

Крім названих похідних пурину і піримідину, в гідролізатах НК міститься кілька десятків інших основ (1-метиладенін, 1-метилгуанін, N2-диметилгуанін, N6-диметиладенін, N7-метилгуанін, 5-метилцитозин, 5-оксиметилцитозин, 4-тіоурацил, дігідроурацил та ін.), які через малу кількість отримали назву екзотичних, або мінорних компонентів. Припускають, що їхня біологічна роль - захист НК від руйнівної дії ферментів. Особливо багато мінорних основ у складі тРНК (близько 60).

Рис. Структура нуклеотиду (J. Watson та ін., 1987)

З п’яти вищеназваних пуринових і піримідинових азотистих основ до складу ДНК входять аденін, гуанін, цитозин і тимін. Вони містяться і в РНК, але замість тиміну присутній урацил.

Назва НК залежить від пентози, що входить до її складу: у ДНК вуглеводний компонент представлений дезоксирибозою, у РНК — рибозою. Ця відмінність у будові рибози і дезоксирибози (заміна у другого вуглецевого атома рибози ОН-групи на Н) сприяє зміцненню зв’язку між другим і третім атомами вуглецю і створює сприятливі умови для компактного укладання молекули ДНК.

Первинна структура ДНК. Залишки нуклеотидів у полінуклеотидному ланцюзі з’єднані фосфодіефірними зв’язками між 5^’ОН-групою пентози одного нуклеотиду і 3^’ОН-групою пентози іншого нуклеотиду. Тому такий зв'язок називається 5^’-3^’-фосфодиефірним. Послідовність розташування чи порядок чергування залишків мононуклеотидів у полінуклеотидному ланцюзі визначає первинну структуру ДНК і РНК. В утворенні первинної структури беруть участь глікозидний зв’язок, що з’єднує азотисті основи з пентозою, ефірний зв’язок між рибозою чи дезоксирибозою і фосфорною кислотою та фосфодіефірний зв’язок між нуклеотидами. Усі ці зв’язки ковалентні, досить міцно стабілізують первинну структуру. При цьому встановлено, що нуклеотиди в полінуклеотидних ланцюгах нуклеїнових кислот зв’язані за допомогою 3′, 5′ -фосфодіефірних зв’язків.

Нуклеотиди з відповідними азотистими основами називають – дезоксиаденозин 5'-фосфат, дезоксигуанозин 5'-фосфат, дезоксицитидин 5'-фосфат, дезокситимидин 5'-фосфат. Дві азотистих основи - аденін і гуанін відносяться до пуринових, а тимін і цитозин - до пірімідинових азотистих основ.

Цукор (дезоксирибоза) одного нуклеотиду з'єднаний через фосфатну групу з цукром наступного нуклеотиду. Ця частина молекули, що називається цукрово-фосфатним остовом, має регулярну структуру. Азотисті основи не беруть участь в утворенні полінуклеотидного ланцюга, тому їх порядок може змінюватися від молекули до молекули (рис.).

Рис. Первинна структура ДНК

Питання щодо встановлення первинної структури ДНК пов’язано з величезними труднощами, оскільки молекулярна маса навіть найменших молекул ДНК обчислюється мільйонами дальтон. Тому за ініціативою і участю СРСР і США у 1988 році було розпочато виконання важливої Міжнародної програми «Геном людини», кінцевою метою якої стало визначення повної генетичної карти людини і розшифрування нуклеотидних послідовностей не тільки в екзонних, але й в інтронних фрагментах ДНК. У 2001 році, але вже без участі СРСР, який на цей час припинив своє існування, вперше було опубліковано відомості про первинну структуру ДНК людини. У вирішенні цього питання брали участь тисячі науковців з більш ніж 20 країн світу. Вони встановили, що у 23-х парах хромосом ядра соматичної клітини людини знаходяться близько 3, 2 млрд. мононуклеотидних пар, не враховуючи нуклеотидний склад мітохондрій. Цікавим є повідомлення про те, що загальна довжина ДНК в ядрах всіх клітин людини досягає астрономічної величини –10¹¹ км, що майже в 1000 разів перевершує відстань від Землі до Сонця.

Вторинна структура ДНК. При вивченні хімічного складу нуклеїнових кислот були встановлені значні розходження у відносному вмісті азотистих основ у різних ДНК, однак молярне співвідношення між аденіном і тиміном, між цитозином і гуаніном у всіх досліджених ДНК залишалося рівним приблизно 1: 1. У 1953 році Джеймс Вотсон і Френсіс Крік опублікували двосторінкову статтю в журналі Nature «Молекулярна структура нуклеїнових кислот: структура нуклеїнових кислот, що містять дезоксирибозу». Ця стаття, в якій вперше була описана коректна модель структури ДНК, стала віхою в новій ері молекулярної генетики, порівнювана з роботами Дарвіна та Менделя. Уотсон, Крик і Уілкінс отримали за цю роботу Нобелівську премію. Уотсон і Крик побудували модель ДНК на основі ряду експериментальних даних. Так, на основі техніки паперової хромотографії, яка успішно використовувалася для визначення хімічного складу білків, біохімік Едвін Чаргафф провів кількісний аналіз нуклеотидів ДНК. У 1949 році він показав, що співвідношення чотирьох нуклеотидів, з яких складається ДНК, є невипадковими. Кількість аденіну у всіх молекулах ДНК дорівнювала кількості тиміну, а кількість гуаніна еквівалентна кількості цитозина - правило Чаргаффа. Ще одна техніка, котра раніше успішно застосовувалася для вивчення білків, була використана у вивченні структури ДНК. Це рентгеноструктурний аналіз. На початку 50-х років ХХ століття M.Wilkins і R. Franklin, які працювали в Королівському коледжі в Лондоні, отримали високоякісні фотографії дифракції рентгенівських променів на кристалах ДНК. Цей аналіз дозволив визначити, що ДНК має спіральну структуру та складається більш ніж з одного полінуклеотидного ланцюга. Пізніше було встановлено, що молекула дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) складається з двох комплементарних полімерних ланцюгів, закручених один навколо одного в формі правобічної спіралі:

Рис. Молекула дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) (J. Watson та ін, 1987)
Кожний з двох полімерних ланцюгів молекули ДНК є полінуклеотидом. Нуклеотиди – складні хімічні сполуки, які складаються з азотистої основи, цукру - дезоксирибози та фосфатної групи (рис.). І пуринові, і пиримідинові основи - це плоскі, відносно водонерозчинні молекули, з'єднані в стопки, перпендикулярні до осі спіралі. Дві нитки з'єднані разом водневими зв'язками між азотистими основами. Аденін завжди спарений з тиміном, а гуанін з цитозином. Це правило називається комплементарністю. Водневі зв'язки формуються між пуриновими та пірімідиновими азотистими основами, інакше формування правильної подвійної спіралі буде неможливим. Між аденином і тиміном формуються два водневих зв'язки, між гуаніном і цитозином - три. Додаткова стабілізація подвійної спіралі забезпечується міжплоскостною взаємодією між азотистими основами. Відстань між сусідніми основами складає 0, 34 нм. Крім того, кожна наступна пара азотистих основ повернена щодо попередньої на 36⁰. Таким чином, через десять нуклеотидів спіраль робить один оборот. Довжина одного витка спіралі становить 34 ангстрема. Два глікозидні зв'язки, якими з'єднуються азотисті основи з дезоксирибозою, лежать не прямо навпроти один одного. В результаті цукрофосфатний остов формує велику та малу борозенки на поверхні молекули. За моделлю Уотсона-Кріка, комплементарні ланцюги мають бути антипаралельними. Тільки в цьому випадку два комплементарні полінуклеотидні ланцюги зможуть сформувати подвійну спіраль (рис.).

Антипаралельна структура ДНК означає, що якщо один кінець полінуклеотидного ланцюга закінчується гідроксильною групою ОН, пов'язаною з третім атомом вуглецю дезоксирибози

(3' – кінець), то другий полінуклеотидний ланцюг повинен закінчуватися трифосфатом, зв'язаним з 5-тим атомом вуглецю дезоксирибози (5' – кінець) (рис.).
Водневі зв'язки і міжплоскостні взаємодії, що стабілізують подвійну спіраль, досить слабкі, при відносно невеликих впливах відбувається розділення ланцюгів – денатурація або плавлення. Дволанцюгова спіральна ДНК у розчині легко руйнується при нагріванні до температур, близьких до 100⁰ С. Денатурація відбувається також при збільшенні рН розчину до рівня, при якому руйнуються водневі зв'язки. Молекули ДНК, що містять більше пар G-C, мають більш високу температуру денатурації, оскільки витрати енергії на розрив трьох водневих зв'язків є більшими. Денатурація є зворотним процесом, відновлення дволанцюгової структури ДНК може відбуватися навіть при повному розходженні ланцюгів. Процес воз'єднання, що називається ренатурацією, реасоціацією або отжигом, відбувається при зниженні температури або рН. Здатність двох окремих комплементарних ланцюгів нуклеїнової кислоти воз'єднуватися з утворенням вихідної структури є ключовим моментом для проведення відповідних дослідів in vitro, а також для виділення, порівняння та ідентифікації нуклеїнових кислот. Унікальна здатність нуклеїнової кислоти утворювати подвійну спіраль шляхом асоціації поодиноких комплементарних ланцюгів має величезне значення для різних галузей генетики та генної інженерії.

Рис.. Антипаралельні комплементарні ланцюги фрагмента ДНК (за Березовим Т.Т. та Коровкіним Б.Ф., 1983)