Анализ колоний, выросших после трансформации

Основными методами, используемыми для анализа колоний, выросших после трансформации лигазной смесью, являются ПЦР с колоний и рестриктный анализ. С помощью ПЦР с колоний обычно выбирают те колонии, которые потенциально содержат лигированный продукт, их наращивают в питательной среде, а из полученной биомассы выделяют ДНК, которую затем подвергают рестриктному анализу. Для рестриктного анализа, как правило, используют две пары рестриктаз: первая пары – это те рестриктазы, которые были использованы при клонировании, а вторая пара – одна из которых расщепляет вектор, а вторая – встраиваемый фрагмент ДНК. Использование ПЦР с колоний уместно только в тех случаях, когда контрольных и опытных чашках выросло много колоний. В случае, когда колонии выросли только на опытной чашке, их можно сразу пересеять в питательную среду, наростить, а из полученной биомассы выделить ДНК и проверить ее правильность методом рестриктного анализа.

Если встраивание целевого гена велось в вектор, содержащий мутантный ген β -галоксидазы, то вместо ПЦР ставят сине-белый тест колоний (см презентацию).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Процесс ПЦР и его стадии Полимеразная цепная реакция – это энзиматический метод увеличения числа копий (амплификация) ограниченного фрагмента ДНК. В качестве источника амплифицируемой последовательности ДНК используется любая ДНК-последовательность, называемая матрицей, аограничение амплифицируемого фрагмента ДНК происходит благодаря специфическому взаимодействию с матрицей коротких олигонуклеотидов, называемых праймерами. Синтез ограниченного участка последовательности ДНК осуществляется с помощью термостабильных ДНК-полимераз, наиболее известной из которых является Taq-полимераза.

Рис.5. Полимеразно-цепная реакция и ее стадии.

Увеличение числа копий синтезируемого фрагмента ДНК происходит благодаря цикличному повторению ряда стадий, протекающих при разных температурах.

Процесс ПЦР состоит из нескольких этапов: стадия общей денатурации исходной двуцепочечной матрицы ДНК, стадия цикла ПЦР и стадия общей элонгации. Каждый цикл ПЦР, в свою очередь, также включает в себя несколько этапов: денатурация уже синтезированной ДНК, специфическое взаимодействие праймеров с матрицей (отжиг) и синтез нуклеотидной последовательности ограниченного фрагмента ДНК под действием ДНК-полимеразы (элонгация). Общую денатурацию обычно проводят при 92°C - 95°C в течение 1-2 минут. На этой стадии происходит разрушение водородных связей между нуклеотидами двуцепочечной матричной ДНК. Эту стадию не следует проводить слишком долго, так как это может привести к разрывам связей внутри одноцепочечной ДНК. Денатурацию также проводят 92°C - 95°C, но в течение 30с. В случае первого цикла на этой стадии происходит дополнительное разрушение водородных связей между нуклеотидами матричной ДНК, а в случае последующих – уже денатурация вновь синтезированных фрагментов. На стадии отжига праймеры специфически взаимодействуют с матрицей, создавая тем самым «затравку» для синтеза нуклеотидной цепи под действием полимеразы. Температура этой стадии может варьировать от 40°C до 60°C и сильно зависит от температуры плавления пары праймеров (T _m), используемых в реакции. Праймеры, используемые для ПЦР, представляют собой короткие олигонуклеотиды размером 20-30 п.о. Очень важно, чтобы температура плавления пары праймеров была практически идентичной. Длительность стадии отжига составляет – 30с. На стадии элонгации происходит синтез ограниченного фрагмента ДНК под действием ДНК-полимеразы. Температура стадии элонгации определяется температурным оптимумом полимеразы, которая используется в реакции. Для Taq-полимеразы, например, эта величина составляет 72°C. Длительность стадии элонгации определяется размером амплифицируемого фрагмента ДНК и скоростью работы полимеразы. Например, синтез последовательности ДНК под действием Taq-полимеразы осуществляется со скоростью 1 kb за 1 минуту. Таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент ДНК размером 2 kb с помощью Taq-полимеразы необходимо задать время элонгации 2 минуты. После окончания стадии элонгации цикл реакций ПЦР вновь повторяется. Число циклов, необходимое для амплификации нужного количества фрагмента ДНК, обычно составляет 20 – 40 и индивидуально в случае каждой конкретной задачи. На завершающей стадии общей элонгации ДНК-полимераза достраивает концы у синтезированных молекул ДНК. Эта стадия протекает при 72°C в течение 5-7 минут.

Компоненты реакции ПЦР Реакция ПЦР проходит в многокомпонентной системе, в состав которой входят буфер реакции, ионы магния Mg²⁺, матрица, «прямой» и «обратный» праймеры, смесь нуклеотидов dNTP и ДНК-полимераза. Об успешности протекания ПЦР можно судить по двум параметрам: количеству синтезированного продукта (выход реакции ПЦР) и специфичности протекания ПЦР (насколько «чистым» является полученный препарат). Если ПЦР используется для амплификации фрагмента ДНК, который в последствии будет использован для клонирования, важным параметром также является отсутствие мутаций в полученном ПЦР-продукте.

Реакционный буфер. Обычно для проведения ПЦР используют 10-кратный коммерческий реакционный буфер, который продается вместе с работающей в нем полимеразой. Как правило, в состав однократного реакционного буфера входит 50 мМ трис-HCl pH 8.6, 50 мМ KCl, 1% Tween –20 или Тритон X-100. Высокий pH реакционного буфера обусловлен его значительным закислением во время протекания ПЦР при нагревании (на стадии элонгации pH реакционной смеси составляет приблизительно 7.5). KCl в концентрации до 100 мМ оказывает стимулирующее действие на активность ДНК-полимераз, а Tween –20 или Тритон X-100 в концентрации 0.1% препятствует сорбции белков на стенках полипропиленовых эппендорфов, в которых проходит ПЦР. В состав некоторых коммерческих буферных растворов также могут входить ионы магния (см. ниже).

Ионы магния. Ионы магния (Mg²⁺) являются необходимым кофактором функционирования всех ДНК-модифицирующих ферментов, в том числе и полимераз. Эти ферменты способны распознавать нуклеотидную последовательность только в комплексе с Mg²⁺. Также Mg²⁺ связывается с последовательностью праймерамов, а также с dNTP. Рабочая концентрация ионов Mg²⁺ в ПЦР смеси находится в диапазоне от 0.5 мМ до 2.5 мМ. Большинство коммерческих буферных растворов содержат ионы Mg²⁺ в концентрации 1.5 мМ. Повышение концентрации Mg²⁺ в реакционной смеси приводит к увеличению выхода ПЦР и одновременно к понижению специфичности ее протекания. Понижение концентрации Mg²⁺, напротив, снижает выход, но увеличивают специфичность. Оптимум концентрации Mg²⁺ в каждом случае свой и определяется температурами плавления матрицы и праймеров.

Матрица. В качестве матрицы для ПЦР можно использовать: 1) плазмиды с уже встроенной последовательностью для амплификации, 2) готовый ПЦР-продукт, 3) одноцепочечную кДНК, синтезированную на основе мРНК методом обратной транскрипции, 4) библиотеки кДНК, полученные из органов и тканей животных и человека, 5) геномную ДНК бактерий, 6) геномную ДНК млекопитающих. Во всех случаях за исключением последнего, количество матрицы, вносимой в ПЦР смесь, обычно составляет от 1 до 20 нг. В случае геномной ДНК млекопитающих это значение составляет от 0.1 до 1 мкг. Если количество матрицы в ПЦР смеси превышает допустимый предел, значительно снижается общий выход ПЦР-реакции. Вероятно, это связано с нарушением процесса общей денатурации двуцепочечной ДНК.

Смесь нуклеотидов (dNTP). dNTP – это эквимолярная смесь четырех видов нуклеотидов, используемая в ПЦР. Диапазон используемых концентраций dNTP в ПЦР смеси составляет от 50 – 500 мкМ. Использование низких концентраций dNTP увеличивает точность синтеза. При смешивании компонентов для ПЦР смеси очень важно, чтобы dNTP находились постоянно на льду, так как нагревание раствора может привести к дезаминированию dATP и включению неправильного нуклеотида в ПЦР-продукт.

Праймеры. Как уже упоминалось ранее, для проведения ПЦР используют «прямой» и «обратный» праймеры. «Прямой» праймер является началом и «затравкой» для синтеза прямой цепи ДНК, а «обратный» праймер, соответственно, - комплементарной ей цепи. Обычно последовательность праймеров для проведения ПЦР создает исследователь с использованием специальной компьютерной программы, а синтез осуществляет коммерческая компания. При создании пары праймеров для ПЦР конкретного участка ДНК необходимо учитывать следующее:

- праймеры должны быть специфичны к амплифицируемому участку ДНК

- длина праймеров составляет 20-30 пар оснований.

- T _m комплементарной части праймеров должна быть сходной

- для того, чтобы стадии отжига и элонгации проходила более эффективно, праймер должен заканчиваться на G или C

- необходимо проверить последовательность праймера на возможность образования вторичной структуры, так называемых «шпилек»

- необходимо проверить, способны ли праймеры образовывать гомо- и гетеродимеры, т.к. это уменьшает концентрацию свободных праймеров в реакционной смеси и снижает общий выход ПЦР.

Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет от 100 до 600 мкМ. Для расчета температуры плавления праймеров используют соответствующие компьютерные программы.

ДНК-полимеразы. Наиболее известной ДНК-полимеразой, используемой для проведения ПЦР, является Taq-полимераза. Этот фермент получают из бактерии Thermus aquaticus, он термостабилен (T_opt = 72°C, может работать даже при 80°С) и является одной из самых «быстрых» ДНК-полимераз (синтезирует 40-50 пар оснований в секунду). В тоже время Taq-полимераза обладает рядом негативных свойств, которые затрудняют ее широкое использование. К таким свойствам относят:

- отсутствие 3’- 5’экзонуклеазной активности (proof-reading activity). Эта активность заключается в своевременном удалении неправильно вставленного нуклеотида в синтезированный продукт и способствует получению ПЦР-продукта, лишенного мутаций. Поскольку у Taq-полимеразы эта активность отсутствует, то ПЦР-продукты, полученные с ее использованием, содержат большое количество мутаций.

- неспособность осуществлять синтез фрагментов ДНК длиной более 4 kb (низкая процессивность)

- неспецифическое встраивание аденозина после окончания синтеза 3’ цепи.

Таким образом, Taq-полимеразу в основном используют для аналитических целей, например, проверки взаимодействия пары праймеров с матрицей и ПЦР-скрининга бактериальных колоний после трансформации (см. ниже). Для таких целей, как синтез ПЦР-продукта для последующего клонирования используют более медленно работающие и более точные полимеразы, как, например, Pfu-полимеразу. Pfu-полимераза представляет собой термостабильный фермент, выделенный из бактерии Parococcus furiosus. Температурный оптимум Pfu-полимеразы чуть ниже, чем в случае Taq-полимеразы, и составляет 68°С - 75°С. Эта полимераза синтезирует в среднем 0.5 kb за 1 минуту и обладает 3’- 5’экзонуклеазной активностью, что существенно повышает точность синтеза. Процессивность Pfu-полимеразы еще ниже, чем в случае Taq-полимеразы. Следует отметить, что при проведении ПЦР с Pfu полимеразой в ПЦР смесь следует вносить больше матрицы, чем в случае Taq-полимеразы.

Сразу после прохождения ПЦР следует заморозить ПЦР-продукт при -20°С или инактивировать полимеразу добавлением ЭДТА, во избежание энзиматической деградации ДНК. Это особенно актуально при использовании полимераз с корректирующей активностью, таких, как Pfu.

В некоторых случаях для амплификации ПЦР-продуктов для клонирования используют смесь двух полимераз Taq и Pfu в соотношении 100: 1 или 50: 1. При использовании такой смеси Taq-полимераза осуществляет быстрый синтез цепи ДНК, а Pfu-полимераза осуществляет удаление неправильно вставленных нуклеотидов.

Проведение ПЦР Для проведения ПЦР необходимо достать все вышеперечисленные реактивы (как правило, их все хранят на -20°С), осторожно разморозить их во льду и перемешать. ДНК-полимеразу достать в последний момент перед добавлением и также поместить в лед. Далее необходимо рассчитать объемы всех реагентов исходя из концентраций стоков и конечных концентраций в ПЦР-смеси. Затем внести все реагенты в полипропиленовую пробирку. ДНК-полимеразу внести в последнюю очередь и перемешать смесь суспендированием. Для осуществления ПЦР используют специальные полипропиленовые тонкостенные пробирки, которые способны к быстрому нагреванию и охлаждению при смене температур (проводить ПЦР в обычных эппендорфах на 0.5 мл нельзя!!!!). Для внесения добавок рекомендуется использовать только стерильные носики, так как ПЦР является высокочувствительным методом и существует вероятность загрязнения и неспецифической амплификации. Затем поместить пробирку в ПЦР-амплификатор и задать температурную программу. ПЦР проводят в термостатируемых ПЦР-амплификаторах, которые могут нагреваться и охлаждаться в зависимости от заданной программой температуры. Основная проблема при быстром нагревании ПЦР-смеси заключается в возможном испарении реакционной смеси и изменении концентрации ее компонентов. В связи с этим, ПЦР-амплификаторы бывают двух типов: с функцией «горячей крышки» и без нее. «Горячая крышка» препятствует образованию конденсата на крышке пробирки и, таким образом, препятствует испарению пробы. В случае использования ПЦР-амплификатора без «горячей крышки», после внесения всех компонентов ПЦР-реакции в пробирку и перемешивания, необходимо аккуратно сверху наслоить 50 мкл минерального масла, которое также препятствует испарению жидкости. После прохождения ПЦР необходимо проанализировать полученные результаты методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Если в дальнейшем планируется использовать полученный ПЦР-продукт для клонирования, его необходимо очистить от компонентов ПЦР-смеси с помощью PCR-purification kit (Qiagen) и заморозить при -20°С.

Обратная транскрипция, совмещенная с полимеразно-цепной реакцией (ОТ-ПЦР)

Еще одним применением метода ПЦР может служить его сочетание с обратной транскрипцией. Данный подход позволяет получать амплифицированные ДНК копии с материала РНК и включает в себя две стадии: синтез кДНК цепи на базе последовательности РНК (обратная транскрипция) и амплификация целевых фрагментов ДНК с полученной кДНК методом ПЦР. Для проведения обратной транскрипции используют короткие фрагменты ДНК («затравки», аналоги праймеров в ПЦР) и обратную транскриптазу – фермент, способный синтезировать цепи ДНК, используя в качетве матрицы РНК. «Затравки» могут быть специфичны к последовательности, которую предполагается затем амплифицировать с помощью ПЦР. Часто в виде «затравок» используют так называемый «Т-праймер» - гомополимер из остатков тимина, длиной 15-20 нуклеотидов, и комплементарный полиА-последовательности клеточных матричных РНК или «случайные» праймеры, которые могут неспецифически взаимодействовать с последовательностью мРНК и инициировать синтез фрагментов короткого размера. В зависимости от условий реакции и вторичной структуры РНК, фермент может достроить к «затравке» несколько тысяч пар оснований, после чего диссоциирует от матрицы. В отдельных случаях после окончания реакции матрицу РНК подвергают деградации под действием РНКазы Н.

Синтезированная молекула кДНК может быть непосредсвенно использована в реакции ПЦР, описанной выше. Следует, однако, отметить, что «затравка» может создавать определенные проблемы в ПЦР, поэтому температура ее отжига должна быть сильно ниже температуры отжига пары праймеров, используемых в ПЦР. Также перед стадией ПЦР кДНК можно предварительно очистить от примеси «затравки».

Рис. 9. Стадии ОТ-ПЦР.