PAAG-электрофоез

Белки разделяютя в полиакриламидном геле, как описано [Sambrook, Russell, 2001], после чего переносятся из геля на мембрану. Гель зливается между стеклами или пластиком, полимеризуется, сначала готовится «нижний», затем «верхний». В «верхнем» геле белки концентрируются из лунки в единый фронт, поэтому концентрация акриламида всегда одинаковая. В «нижнем» же белки уже разделяются в соответствии с их массой, в связи с чем концентрация акриламида варьируется. Сайт молбиол советует выбирать концентрацию акриламида «нижнего» геля следующим образом:

Стекла нужно хорошо мыть, во избежание искажений подвижности белков, особенно это актуально для больших макси-камер. Камера между стеклами, установленными в систему для заливки геля, проверяется на герметичность спиртом, затем он удаляется. Чтобы понять сколько нужно залить нижнего геля, нужно вставить гребенку и отступить вниз 1.5-2 см, пометить фломастером. Объемы нижнего и верхнего геля звисят от толщины гребенки. У Bio-Rad это 0, 7 мм. На одну миникамеру уходит около 5 мл нижнего геля и 3 мл верхнего. Делайте немного с избытком, чтобы проверить процесс полимеризации по оставшейся части геля в стаканчике. Процесс полимеризации зависит от температуры окружающей среды.

TEMED стараться не вдыхать, очень ядовит. PSA готовится из порошка белого цвета на воде и аликвотится по 1мл; считается, что годный порошок при растворении дает похрустывание. Если он старый, полимеризация не произойдет.

Итак, собрать камеру из стекол в заливочном столике, проверить на герметичность. В принципе, новые системы не текут. Смешать раствор нижнего геля на одну или две камеры, залили между стеклами до нужной высоты. Наслоить воду или изопропанол до верха стекла (Вы увидите границу между гелем и водой четко, когда гель заплимеризуется). Ждете полимеризацию, контролируете процесс по оставшейся части смеси в стаканчике. После через край сливаете воду, остатки удаляете фильтровальной бумагой.

Затем готовится верхний гель, делать нужно бытрее, т.к. он быстрее полимеризуется. Не до конца вставив гребнку, аккуратно заливается верхний гель, гребенка вствляется до упора. Обратите внимание, чтобы не было пузырей.

Готовый гель с гребенкой можно хранить на +4 в TGB, считается, даже лучше готовить его в предыдущий день, но не обязательно.

Для электрофореза переносится залитый гель в стеклах в камеру для фореза и устанавливается согласно полюсам, если стекло одно, то вторую ставится заглушка, наливается во внутреннюю камеру буфер для фореза (TGB), чтобы покрыть лунки, а во внешнюю около 1/3. Вынимается гребенка, тщательно промываются лунки, чтобы там не осталось «нитей» геля, т.к. они пемешают нанести образцы в лунки.

Чтобы карманы геля было лучше видно, можно сначала нанести везде немного буфера для нанесения. Потом наносите образцы и маркер. Есть маркер, который после прохода фореза не виден, его надо красить Кумасси, обращайте на это внимание и соответствует ли это вашей цели.

Закрывается крышку камеры, включается ток. В концентрирующем геле белки надо прогнать при 80-100 В, в разделяющем 150-180 В. Разделение проходит до достижения синей краски низа геля или дальше, смотрится по маркеру. Также как и в случае ДНК маленькие белки идут бытрее.

Теперь гель можно покрасить Кумасси или серебром, если, например, надо посмотреть экспрессию белка в бактериях или сделать Western блот.