Фагоцитоз и молекулярные механизмы формирования сигнальных путей, опосредованного через активацию fc– и tlr–peцепторов.

Уже говорилось о том, что фагоцитоз является одной из важнейших защитных клеточных реакций, направленных на элиминацию попавших в организм патогенов (глава 1). Многочисленными экспериментальными исследованиями установлено, что распознавание и связывание поверхностными Рц соответствующих лигандов (например, Рц для Fc–фрагмента IgG опсонизированных IgGмикробов) сопровождается полимеризацией актина (превращение низкомолекулярного G–актина в нитевидный полимеризованный F-актин) под мембраной в зоне контакта лиганд–Рц, обволакиванием обогащенной актином мембраной фагоцитируемой частицы с образованием фагосомы, слиянием фагосомы с богатой кислыми протеазами и гидролазами лизосомои и расщеплением литическими ферментами фагоцитированного материала. Всего в лизосомах охарактеризовано более 60 различных ферментов. В результате активации профессиональные фагоциты (макрофаги, моноциты, нейтрофилы), продуцируя и секретируя биологически активные молекулы (цитокины, литические ферменты, компоненты комплемента, окислительные радикалы, гормоны и др.), обеспечивают развитие доиммунного воспаления и представляя молекулы переработанного Аг Аг–распознающим лимфоцитам, участвуют в становлении адаптивного иммунитета. Эти превращения клетки, начиная от полимеризации актина до секреции продуктов фагоцитов, осуществляются под влиянием сигналов, генерируемых в результате взаимодействия лиганд–Рц. Ряд молекул, участвующих в формировании сигнального пути, обеспечивающего развитие фагоцитарной реакции, описан D.M. Underhill [568].

Важнейшим этапом процесса фагоцитоза, индуцирующего формирование сигнального пути, является фосфорилирование цитоплазматических доменов Fc–Рц — молекул ITAM тирозинкиназами семейства Src. Это сопровождается блокадой ингибиторов тирозинкиназ, обеспечивающей дальнейшее прохождение сигнала в клетку.

Члены семейства молекул низкомолекулярных гуанозинтрифосфатаз Rho — Cdc42, Rac, Rho являются одними из ключевых регуляторов состояния актина цитоскелета. Эти молекулы координируют динамику изменений актина в процессе адгезии клетки, её миграции, участвуют в сигнальном каскаде, включая активацию киназ MAP (от — Mitogen–activated protein) при воспалительном ответе, индуцированном в процессе фагоцитоза, и активацию факторов транскрипции, таких как белок АP–1 (от — Activator Protein–1). Молекулам Cdc42 и Rac принадлежит важная роль в фагоцитозе, опосредованном через Fc–Рц. Это было продемонстрировано экспериментальными исследованиями, показавшими, что экспрессия мутантов этих белков блокирует поглощение макрофагами и тучными клетками частиц, опсонизированных IgG, но не комплементом. В то же время, фагоцитоз, опосредованный через Fc–Рц, присутствия молекул Rho семейства Rho не требует. В связи с той ролью, которую играют молекулы семейства Rho в промежутке между активацией актина цитоскелета и внутриклеточным сигнализированием, эти белки рассматриваются в качестве кандидатных молекул, соединяющих фагоцитоз с индуцированным им воспалительным ответом.

Существенную роль в генерировании сигнала, необходимого для поглощения фагоцитуемого материала, играют также по меньшей мере пять из 12 описанных изоформ протеинкиназы С — PKC (от — Protein kinase С): PKC–a, –b, –e, –d, –z. Эти молекулы экспрессируются в макрофагах и включаются в мембрану на самых ранних этапах фагоцитоза. Блокирование активности PKC подавляет образование филаментов актина под участками связывания частиц и блокирует поглощение частиц, опсонизированных IgG, комплементом или зимозаном. Опосредованная PKC активация интегрина a_Мb₂ определяет также развитие реакции фагоцитоза через Рц CR3. Более того, PKC необходима для продукции цитокинов клеткой и для её противомикробной активации, индуцируемой разными агентами. Показано, что фармакологическое подавление активности PKC сопровождается подавлением индуцированной ЛПС выработки циклооксигеназы–2, ИЛ–1b и TNFa, активацией респираторного взрыва. В регуляции взаимодействия актина цитоскелета с плазматической мембраной в процессе фагоцитоза и реорганизации клеточной мембраны участвуют также белки семейства MARCKS (от — Myristoylated Alanine-Rich protein Kinase C Substrate). Фосфорилирование белков этого семейства и активация интегриновых Рц сопровождаются снижением активности PKC.

В активации PKC важная роль принадлежит фосфолипазе С (PLC–g Как и в случае с PKC, подававление активности PLC– g полностью блокирует образование филаментов актина под участками связывания фагоцитируемых частиц. Активацию PLC– g обеспечивает белок G, связанный с рядом Рц фагоцита (для молекул адгезии, иммунных комплексов, хемотаксических агентов и др.) и диссоциируемый при взаимодействии лиганд–Рц. Механизм активации PKC фосфолипазой С включает расщепление этим ферментом фосфатидилинозитол–4, 5–бифосфата (РIР₂) до высвобождения молекул фосфатидилинозитол трифосфата (РIР₃) и диацилглицерина (ДАГ), вторичных мессенджеров, которые, соответственно, мобилизуют запасы внутриклеточного Ca²⁺ и активируют семейство молекул PKC. Фосфорилирование фосфатидилинозитол–4, 5-бифосфата катализирует фосфатидилинозитол–3–киназа (PI–3K — от Phosphatidil inositol–3-kinase). Образующийся при этом фосфолипид фосфатидилинозит–3, 4, 5-трифосфат (PIP₃) вовлекает в процесс фагоцитоза ряд сигнальных молекул, в частности киназу АКТ/РКВ (от — kinase autologous tumor killing/protein kinase В). Угнетение активности PI–3К блокирует процесс фагоцитоза различных частиц, включая бактерии, частицы, опсонизированные IgG или комплементом, неопсонизированный зимозан и др. Однако при этом первичные этапы сигнального пути, включающие связывание частиц с Рц или полимеризацию актина, не нарушаются.

Необходимо отметить, что как PLC–g так и PI–3К, участвуют в качестве сигнальных молекул не только в каскаде реакций, обеспечивающих развитие фагоцитоза, но и в реакциях, направленных на развитие воспалительного ответа. Так, PLC–g участвует в активации МАP–киназы (от — Mitogen-Activated Protein kinase), необходимой в процессе активации тирозинкиназы. Этот фермент в качестве сигнальной молекулы участвует в развитии воспалительного ответа, индуцируемого в результате опосредованного через Fc–Рц фагоцитоза частиц, опсонизированных IgG. Активацию тирозинкиназы обеспечивает также фосфорилирование молекул ITAM, приводящее, как отмечалось выше, к блокаде ингибиторов тирозинкиназ, обеспечивающей дальнейшее прохождение сигнала в клетку. В случае PI–3К наблюдается её активация молекулами TLR, что сопровождается участием PI–3K в индукции транслокации молекул NFkB В клеточное ядро и в индукции патогенами выработки цитокинов макрофагами.

Одним из явлений, раскрывающих механизмы врождённой физиологической защиты организмов от патогенов и вскрытых в последние годы, явилось обнаружение Toll-продобных Рц (TLR) на фагоцитах, характеризующихся элементами специфичности и позволяющих последним отличать вообще «чужое» от вообще «своего» путём распознавания молекулярной мозаики патогена — PAMP(глава 1). Одной из наиболее хорошо известных структур РАМР является ЛПС — основной компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Как известно, ЛПС обладает способностью стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов АПК и экспрессию ряда поверхностных костимулирующих молекул, например CD40 (относится к надсемейству TNF, необходим для рецепции сигналов, сопровождающихся процессами пролиферации, дифференцировки, переключения изотипов Ig в B–лимфоцитах, для продукции цитокинов дендритными клетками и макрофагами).

При избытке ЛПС могут возникать явления эндотоксического шока с высоким смертельным исходом. Показано, что ЛПС распознаётся и связывается сывороточным ЛПC–связывающим белком ЛПС–СБ. Этот белок относится к реактантам острой фазы, его сывороточная концентрация возрастает после различных воспалительных процессов любой анатомической локализации — при ожогах, туберкулёзе, перитоните, сепсисе, артрите, родах, при различных химических поражениях и т.д. Важными регуляторами экспрессии ЛПС–СБ в клетках являются ИЛ–1, ИЛ–6 и TNF. Существенное влияние на экспрессию ЛПС–СБ в изученных линиях клеток играет дексаметазон. Будучи опсонином и повышая чувствительность клеток к ЛПС, ЛПС–СБ обладает уникальной способностью не только связывать ЛПС фрагментов бактериальной мембраны, но и обеспечивать «перемещение» ЛПС к клеткам–мишеням, экспрессирующим молекулы CD14 — расположенные вблизи от TLR4 макрофагальные поверхностные Рц, связывающие комплекс ЛПC–ЛПС–СБ, критические для удержания ЛПС на клеточной мембране. Активацию клеток ЛПС усиливает также растворимая форма CD14 — плазматический гликопротеин, функционирующий таким же образом как и поверхностный Рц CD14. Считается, что функции связывания и перемещения ЛПС выполняют разные домены ЛПС–СБ. Один из его фрагментов, представленный АК–остатками 1–197, обладает способностью авидно связывать ЛПС, но не обладает способностью его перемещать. Связывание ЛПС с молекулой CD14, как предполагается, обеспечивает другой фрагмент ЛПС–СБ — с АК–остатками 198–456 [557]. Следует отметить, что Рц CD14 не способен к проведению сигнала внутрь клетки, поскольку он заякорен в клеточной мембране через его хвостовую часть — гликозилфосфатидилинозитол. Эту роль выполняет при помощи домена TIRповерхностная клеточная структура TLR4–MD2 [307.], распознающая ЛПС и взаимодействующая с комплексом ЛПC–CD 14 (рис. 47). В комплексе TLR4–MD2 молекула TIR является цитоплазматическим доменом Рц TLR4, обеспечивающим проведение сигнала внутрь клетки, a MD2 — это секреторная молекула, которая ассоциирована с TLR4, регулирует экспрессию TLR4 на клеточной поверхности и обеспечивает отвечаемость TLR4 на ЛПС (может связываться с ЛПС независимо от ЛПС–СБ CD14). В соответствии с данными последних лет функциональный рецепторный комплекс для ЛПС включает также Рц для белков теплового шока и для хемокинов [562]. Показано например, что CD14 обладает способностью усиливать активацию клеток к большому количеству распознаваемых этой молекулой лигандов, среди которых, помимо уже обозначенных, могут быть названы HSP–60, HSP–70, гликопротеин слияния респираторно-синцитиального вируса и др. [557].

Рис. 47. Передача активирующего сигнала через комплекс CD14-Тоll-подобный рецептор. ЛПС — липополисахарид; ЛПС–СБ — ЛПC–связывающий белок; CD14 — Рц для комплекса ЛПC–ЛПС–СБ; TLR4 — Toll- подобный Рц 4 (от — Toll–like receptor 4); TIR — цитоплазматический домен Рц TLR4, гомологичного Рц для интерлейкина–1 (TIR — от — Toll/lnterleukine–1 receptor homologydomain), обеспечивающий проведение сигнала; MD2 — секреторная молекула, ассоциированная с TLR4, регулирующая экспрессию TLR4 на мембране фагоцита и обеспечивающая отвечаемость TLR4 на ЛПС (может связываться с ЛПС независимо от ЛПС–СБ и CD14). Пояснения в тексте.

Важно отметить, что АК–последовательность цитоплазматического домена Toll-подобных Рц (TLR) оказалась подобной таковому Рц для ИЛ–1. Именно поэтому этот домен обозначен как гомологичный домен Рц TIR (от — Toll/IL–1R homology domain), или TIR–домен. Его взаимодействие с цитоплазматической молекулой MyD88 (адаптерный белок) является важнейшим этапом анализируемого сигнального пути. Показано также, что отдельные TLR–Рц способны распознавать не только молекулярную мозаику патогена, но и отдельные химические соединения, например, имидазохинолины (TLR7), различные молекулы собственного организма, например белок теплового шока 60 и калретикулин (TLR4) или продукты деградации компонентов внеклеточного матрикса — фибриногена или домена EDA (от — Extra Domain А) фибронектина при воспалении или повреждении тканей (TLR4). Распознавание молекулярной мозаики патогена и связывание TLR–Рц соответствующих лигандов является важнейшим этапом в получении фагоцитом сигнала, необходимого для его активации.

В формировании сигнального пути, опосредованного через активированные TLR–Рц значимой является белковая молекула MyD88. Показано, что первичное взаимодействие лиганд–Рц сопровождается активацией белкового комплекса клетки. Эта активация осуществляется через цитоплазматическую адаптерную молекулу MyD88, являющуюся его компонентом. Связываясь сTIR–доменом Рц, молекула MyD88 взаимодействует с протеинкиназой IRAK через консервативный домен DD (от — Death Domain) — компонент апоптотических белков. Активация протеинкиназы IRAK вовлекает в процесс адаптерный белок TRAF–6 (от — Tumor necrosis factor receptor–associated factor 6), взаимодействие которого с NFkB–индуцирующей киназой NIK (от —NFkB–Inducing Kinase) сопровождается фосфорилированием киназы Ikk (от — IkВ kinase), являющейся ингибитором фактора транскрипции NFkB (от Nuclear Factor — ядерный фактор, усиливающий транскрипцию лёгкой цепи k Ig B–лимфоцитов). В результате фосфорилирования IkВ отделяется от фактора транскрипции NFkB, который транслоцируется в ядро и стимулирует транскрипцию соответствующего гена (рис. 48).

Рис. 48. Проведение сигнала внутрь клетки при распознавании микроба Toll-подобным рецептором фагоцита. TLR (от — Toll–like receptor) — Toll–подобный Рц с доменом TIR (Toll/ИЛ–1Rreceptor homology domain); MyD88 (MYeloid Differentiation factor 88) — адаптерный белок; DD (от Death domain) — домен «смерти»; IRAK — серин–треониновая киназа, ассоциированная с Рц для ИЛ–1; TRAF–6 (от — TNF receptor–associated factor 6) — фактор 6, ассоциированный с Рц для фактора некроза опухоли; NIK (о NF k B–inducing kinase) — киназа, индуцирующая фактор транскрипции NF k Β; IKK (от Ι k Β kinase) — киназа Ι k Β. Пояснения в тексте.

По современным представлениям, у млекопитающих IkВ входит в состав 7–членного семейства ингибиторных белков, различающихся по аффинности к NFkB степени его подавления, кинетике деградации и ресинтеза. Эти белки включают IkВa, IkВb, IkВg (наиболее сильные ингибиторы NFkB), IkВe, Bcl–3 и предшественники белков Rel — p100 и р105. В свою очередь, у млекопитающихNFkВ входит в группу из пяти эвлюционно консервативных родственных белков — Rel (c–Rel), RelA (р65), RelB, NFkB1 (р50 и его предшественник р105) и NFkB2 (р52 и его предшественник р105), в которой Rel и NFkB формируют гомо- и гетеродимеры, активирующие гены–мишени. Показано, что все молекулы NFkB/Rel характеризуются наличием высококонсервативного NH₂–концевогoдомена Rel (RHD), обеспечивающего димеризацию, взаимодействие с ингибиторными белками IkВ и связывание молекулы с ДНК. Спектр активируемых генов зависит от особенностей комбинаций IkВ–NFkB, которые в свою очередь зависят от типа клеток и природы стимула [36]. Считается, что IKK фосфорилируется непосредственно МАP–киназой МАРК (от — Mitogen–activated protein kinase) с помощью киназы ТАК1 (Transforming growth factor — activated kinase 1), которая будучи связанной с белками TAB 1 (от — ТАК1 binding protein) и TAB 2 активируется адаптерным белком TRAF–6 [505]. Результатом процесса транскрипции является продукция провоспалительных цитокинов (ИЛ–1, 6, 8, 12, TNFa, ГМ–КСФ и др.), хемокинов, индукция экспресии костимулирующих молекул (CD80 и CD86) в дендритных клетках и их мобилизация и миграция из очага внедрения патогена в региональные лимфатические узлы, инициация адаптивного иммунного ответа. NFkB активирует также гены, кодирующие молекулы адгезии (VCAM, ICAM, ELAM и др.), острофазные белки, противомикробные пептиды b–дефензины) и др. Одновременно с индукцией цитокиновой сети под влиянием молекулы MyD88, связывающей молекулу FADD, запускается процесс апоптоза через каскад каспаз.

Описанный сигнальный путь у млекопитающих, завершающийся генной транскрипцией, во многих чертах сходен с таковым у растений и насекомых, что даёт основания отнести его к древним механизмам защитной сигнальной системы [189, 505].