Механизмы подавления активности иммунокомпетентных клеток при интенсивной стресc–реакции

Иная ситуация возникает при длительных и интенсивных стрессорных воздействиях. Так например, в течение 2-х недель после хирургического стресса у больных с желудочно-кишечными опухолями I стадии регистрировалось снижение численности периферических лимфоцитов, снижалось число T–хелперов и возрастало число T–супрессоров, падало число NK, количество клеток с Рц для ИЛ–2 и цитотоксических T–клеток, в крови повышался уровень реактантов острой фазы, наблюдалась гиперсекреция ГКС (кортизол) [441]. Повышение концентрации ГКС позволяет им проникать в клетки за счёт пассивной диффузии и связываться с Рц для ГКС, который находится в цитоплазме. Этот белок представляет из себя пептид с молекулярной массой около 300 кД. Активированный благодаря присоединению кортикостероида, комплекс гормон–Рц проникает в ядро, связывается с определёнными участками ДНК и осуществляет регуляцию транскрипции генов. В результате тормозится синтез ИЛ–1, –2, –3, –4, –5, –6, –8, –11, –12, –13, ИФНg, TNFa. Снижается экспрессия важнейших для межклеточного взаимодействия молкул адгезии. Активируется синтез липокортинов, которые, в частности, тормозят активность фосфолипазы А2. Глюкокортикоиды также тормозят или снижают действие таких медиаторов воспаления, как простагландины, лейкотриены, брадикинин, гистамин [72].

Ещё более драматические события развиваются при повышении концентрации ГКС до той, которая вызывает апоптоз. В условиях интенсивного стресса апоптоз, развивающийся в пределах 10–12 часов после действия индукторных факторов, служит важной причиной снижения функциональной активности клеток иммунной системы (глава 7 «Возбуждение и торможение иммунной системы», раздел «Апоптоз и его место в развитии и функционировании иммунной системы»). К действию глюкокортикоидов наиболее чувствительны кортикальные тимоциты фенотипа CD4⁺CD8⁺, не экспрессирующие протоонкоген Вс1–2 — продукт гена, блокирующего развитие апоптоза. Среди периферических клеток B–лимфоциты более устойчивы, по сравнению с T–клетками. Предшественники T– и B–лимфоцитов устойчивы к действию кортикоидов. Покоящиеся зрелые тимоциты апоптозу не подвержены, однако они становятся чувствительными к апоптозу после активации — по этому механизму гибнет значительная часть лимфоцитов при развертывании иммунного ответа и все эффекторные клетки после завершения функций [84].

Анализ экспрессии рецепторных структур лимфоцитов при остром и хроническом стрессе обнаружил изменение чувствительности клеток к глюкокортикоидам и катехоламинам, уровень которых увеличивался при остром стрессе и не изменялся при хроническом. При этом продукция АТ к T–зависимым, но не к T–независимым Аг существенно подавлялась при хроническом стрессе. В связи с этим можно заключить, что нарушение T–зависимого гуморального ответа не связано с изменениями в уровне глюкокортикоидов и катехоламинов, но коррелирует с повышенной чувствительностью T–клеток к стрессовым гормонам, Рц которых вовлечены в процессы изменения иммунного ответа при стрессе и депрессивных состояниях [528, 529].

Инкубация тимоцитов мышей с дексаметазоном или кортикостероном в течение нескольких часов приводит к их гибели. Это связано с синтезом РНК или белка, поскольку блокаторы синтеза предотвращают клеточную гибель. Гибель клеток связана с фрагментацией ядерной ДНК до олигонуклеосомальных СЕ, требующей синтеза РНК и белков. Расщепление ДНК является результатом действия эндонуклеазы, которая избирательно разрушает ДНК в зонах между нуклеосомами. Эндонуклеаза постоянно содержится в ядрах тимоцитов, для её активации необходимы ионы Са и Mg. Если выделенные ядра инкубировать с этими ионами, то до 77% ДНК разрушается за 90 мин. Белок, синтез которого необходим для вызванной ГКС гибели клеток, не является самой эндонуклеазой, а действует как её активатор, открывая эндоплазматические каналы для ионов. Зрелые T–лимфоциты также содержат ядерную эндонуклеазу, но они слабо синтезируют её активаторы под влиянием ГКС и поэтому значительно более устойчивы к ним.

В реализации стресc–реакции принимают участие тучные клетки. Показано, что в условиях острого стресса тучные клетки активируются через их Fc–Рц иммуноглобулинами не IgE–класса, также как и анафилатоксинами, цитокинами и нейропептидами, и селективно секретируют медиаторы без видимой клеточной дегрануляции [555]. Под влиянием клеточного стресса, индуцируемого ЛПС энтеро-бактерий через активацию другого Рц — TLR4, тучные клетки продуцируют ряд провоспалительных цитокинов — ИЛ–1b, TNFa, ИЛ–6, ИЛ–13 [544]. Роль количественных и качественных изменений тучных клеток, также как тромбоцитов, фагоцитов и других клеток при стрессе и значимость этих клеток в изменении реактивности организма и в формировании адаптационных реакций детально рассмотрена В.А. Черешневым и соавт. [89].

Важнейшую роль в поддержании генетической целостности организма играют NK [фенотип CD3^–, CD16⁺(FcgRIIIA), CD56⁺(N–CAM)]. Активность этих клеток при стрессе изменяется, в зависимости от характера и интенсивности стрессовых воздействий — подавляется или, наоборот, стимулируется. Как оказалось, активация этих клеток регулируется балансом мембранных рецепторных структур, обеспечивающих проведение внутрь клетки активирующих или ингибирующих сигналов. Было показано, что такого рода структуры представлены рядом относящихся к различным семействам Рц, специфических по отношению к разным аллелям MHC класса I, экспрессируемых только на NK или имеющихся и на других типах клеток и играющих критическую роль в регуляции литической активности NK и в их способности секретировать цитокиновые молекулы. Следует подчеркнуть, что проявление литической активности NK не требует предварительной их сенсибилизации и не ограничено молекулами, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости. Считают, что литическая активность NK направлена на организменные клетки–мишени с подавленной экспрессией отдельных или всех Аг MHC класса I, поэтому распознавание клеток–мишеней NK связано с «отсутствием своего» на мишенях, обычно представленных трансформированными клетками или клетками, инфицированными вирусом [156].

К числу регуляторных относят четыре основных типа уникальных рецепторных структур NK — NCR, KIR, ILT и CD94/NKG2. Другие Рц, активирующие EKK–CD2, CD16, CD26, CD69, b₁-интегрины, экспрессируются на многих других типах клеток.

Рц естественной цитотоксичности NCR (от — Natural cytotoxicity receptor) были открыты и описаны L.Moretta et al. [415]. Они являются специфическими для NK структурами, которые непосредственно активируют NK, включают молекулы NKp30, NKp44 и NKp46 [561]. К числу активирующих относятся также Рц KIR2DS, CD94/NKG2C, -Е, -Н и NKG2D [156, 368]. Рц NKG2Dэкспрессируют NK (как гомодимер вместе с адаптерной молекулой DAP10), Tab и Tgd–лимфоциты. Этот Рц подаёт необходимые костимулирующие сигналы для CD8-позитивных T–лимфоцитов, его лигандами являются молекулы ULBPs, а также Аг MICA и MICB MHC класса I (глава 5, раздел «Гены HLA и их продукты»). Лиганды Рц NKG2D индуцируются при клеточном стрессе, в частности при вирусной (CMV) и бактериальной инфекции (М. tuberculosis, E. coli). В качестве лигандов для Рц CD94/NKG2 выступают молекулы локуса HLA–E.

L. Moretta et al. [416] описали субпопуляцию цитотоксических T–лимфоцитов с естественной киллерной активностью (NK–ЦТЛ), экспрессирующих Аг CD8 и взаимодействующих с лидерными последовательностями различных аллельных вариантов пептидов неклассических молекул локуса HLA–E MHC класса I, индуцируемых вирусными белками.

К ингибирующим Рц NK относятся лектиноподобные Рц CD94/NKG2A, -В (гетеродимер CD94, ковалентно связанный с молекулой NKG2) и надсемейства трансмембранных Рц KIR (от — Killercell Immunoglobulin–like Receptor) и ILT (от — Immunoglobulin–Like Transcript). Синонимами Рц ILT являются Рц LIR (от — Leucocyte immunoglobulin–like receptor) и MIR (от — MacrophageImmunoglobulin–like Receptor). Надсемейство KIR включает 12 Рц — KIR2DL1, –2/L3, –4, –5, KIR2DS1, –2, –4, –5, –6, KIR3DL1/S1, –2, –7. Среди них Рц KIR2DL4 специфически взаимодействует с пептидами HLA–G1, по другим данным пептиды локуса HLA–G с Рц KIR2DL4 не связываются [156]. Надсемейство ILT включает 11 Рц — ILT1–11, Рц ILT2 или LIR1 и IL4 или LIR2, помимо NK экспрессируются на T– и B–лимфоцитах и на клетках миелоидной линии дифференцировки, взаимодействуют с широким спектром классических лигандов Iа комплекса HLA и с неклассическими пептидами HLA–G1 [156, 368, 561, 588].

Как отмечалось выше, Рц NK распознают идентичные или подобные лиганды и формируют сигнальные пути, баланс которых при стрессе приводит к активации или к угнетению функциональной активности NK. Активация рецепторных структур NK при взаимодействии лиганд–Рц обеспечивается через активацию цитоплазматического домена ITAM адаптерного белка DAP12, связанного с Рц и вовлекающего в процесс активации домен SH2, который содержат тирозиновые протеинкиназы Syk или ZAP–70. В отличие от других ITAM-несущих активирующих Рц, NKG2D связывается с адаптерным белком DAP10, несущим вместо ITAM АК–последовательность YxxM, обладающую SH2–связывающей способностью. DAP10 вовлекает в процесс активации не тирозиновые протеинкиназы Syk или ZAP–70, а киназу PI–3. Ингибиторные Рц NK несут цитоплазматический домен ITIM, дефосфорилирование которого обеспечивает молекула SHP–2 [156]. Последующие этапы формирования сигнального пути аналогичны описанным выше (глава 7 «Возбуждение и торможение иммунной системы»).

Совершенно очевидно, что под влиянием стресса, приводящего к перераспределению лимфоидных клеток, к изменению гормонального и цитокинового статусов организма и, в результате, к нарушению клеточных функций, происходят сдвиги молекулярных событий в клетках, приводящие к нарушению процессов нормального функционирования различных клеточных систем организма, не только NK. Рассмотрим лишь основные изменения сигнальных путей, характерные для разных клеточных элементов. Прежде всего — это активация фактора транскрипции NFkB, центрального регулятора стрессового ответа, играющего важную роль в процессах клеточной пролиферации и дифференцировки. Активацию NFkB обеспечивают различные стрессовые воздействия на клетку (физический и окислительный стрессы, бактериальные и вирусные инфекции, воздействия различных химических агентов и др.), приводящие к изменению баланса окислительно-восстановительного потенциала клетки и в результате к быстрому фосфорилированию и протеолитической деградации киназы IkK, ингибитора NFkB, что в конечном итоге приводит к освобождению NFkB И Кэкспрессии многих воспалительных цитокинов, хемокинов, поверхностных молекул адгезии, различных рецепторных структур [363, 585].

Как отмечалось выше (глава 7) важная роль в регуляции клеточной активности принадлежит семейству киназ MAP, контролирующих экспрессию генов, регулирующих многие клеточные функции, включая пролиферацию клеток и их дифференцировку. Это семейство включает три подсемейства — киназы, регулируемые внеклеточным сигналом ERK (от — Extracellular signal regulated kinases), киназы, активируемые стрессом SARK (от — Stress activated protein kinases) или N–терминальные киназы c–Jun JNK (от c–Jun N–terminal kinases) и киназа р38. Киназы ERK активируются под влиянием митогенного стимула, их активность контролируется семейством белков Ras через серин/треонин протеинкиназу Raf. Киназы SARK или JNK и р38 активируются в результате стресc–реакции. Эта активация носит каскадный характер. Киназы SARK или JNK и р38 (киназы МАРК) активируются в результате фосфорилирования членами группы МАРКК (от — МАРК kinase) — МКК4, МКК7 и МКК3, МКК6, соответственно, которые в свою очередь активируются в результате фосфорилирования членов группы киназы МАРККК (от — МАРКК kinase) — ASC1, MEKK, MLK, TAK1 TPL–2 [205]. Активацию киназ SARK или JNK и р38 контролируют молекулы семейства Rho. В контролирующих функциях семейства Ras/Rho важная функция принадлежит GT–фосфатазам, обеспечивающим переход внеклеточного сигнала во внутриклеточный. В качестве такого сигнала могут выступать провоспалительные цитокины (ИЛ–1, TNF, др.) и другие воздействия, стрессирующие клетки–мишени. Так, TNF индуцирует активацию МАP–киназ через Рц p55 (TNF–R55) и р75 (TNF–R75), экспрессируемые на большинстве клеточных типов, ИЛ–1 — через домен TIR–Рц TLR/ИЛ–1R. В этой активации важная роль принадлежит Рц типа I (ИЛ–1RI) для ИЛ–1 и TLR2 (активируется лигандами грамположительных бактерий) и TLR4 (активируется лигандами грамотрицательных бактерий) [444]. Как отмечалось выше (глава 7), в регуляции активности МАP–киназ важную роль играет адаптерный белок — фактор 6, ассоциированный с Рц для TNF — TRAF–6 (от TNF receptor–associated factor 6), а в проведении сигнального пути через Рц для TNF (TNFR — Tumor Necrosis Factor Receptor) участвует киназа IRAK, ассоциированная с Рц для ИЛ–1 [298].

На сигнальные пути, в которых участвуют активированные стрессом протеинкиназы, существенное влияние оказывают продукты отдельных генов, экспрессию которых индуцирует повышенная, индуцируемая стрессом, секреция глюкокортикоидов [187].

Приведенные данные далеко не исчерпывают те тонкие молекулярные механизмы, которые характеризуют индуцируемую стрессом активацию различных типов клеток, участвующих в защите организма от различных воздействий и в конечном счёте — в поддержании генетического гомеостаза. Они требуют дальнейшей расшифровки. В этом плане крайне важными являются исследования, направленные как на изучение молекулярных событий, влияющих на функции иммунной системы, так и на исследование взаимодействия различных организменных систем, в частности нейроэндокринной, с системой иммунитета.

В целом, снижение иммунокомпетентности при стрессе обусловлено следующими основными механизмами:

· перераспределением иммунокомпетентных клеток с опустошением зон, обеспечивающих наиболее благоприятные условия для развития оптимального иммунного ответа (например, селезёнка, лимфатические узлы);

· активацией различных организменных систем (генов, рецепторного аппарата клеток, сигнальных путей), сопровождающихся изменением функциональной активности иммунокомпетентных клеток;

· усилением запрограммированной гибели клеток (апоптоз) под действием ГКС.

Повышение уровня ГКС до концентраций, вызывающих значительное снижение синтеза медиаторов межклеточного взаимодействия и апоптоз, приводит к драматическим изменениям в иммунной системе. Одним из ранних показателей развивающихся нарушений является уменьшение содержания иммуноглобулинов и уровня нормальных АТ. Это происходит, в частности, при напряжении, связанном с защитой диссертации. У спортсменов высокого класса в период усиленной тренировки и ответственных соревнований снижается уровень иммуноглобулинов в крови, вплоть до полного исчезновения некоторых классов — IgG [41], падает также уровень IgM [42], возрастает заболеваемость аллергическими болезнями с преобладанием повышенной чувствительности к бытовым и пыльцевым аллергенам [92]. Уменьшение способности к иммунному ответу у спортсменов в период высокого психоэмоционального напряжения продемонстрировано при их вакцинации, тогда как при умеренных тренировках вакцинный эффект может повышаться [222]. В период стресса снижается способность лимфоцитов отвечать на митогены и пролиферировать под их влиянием [62]. Эти изменения могут сохраняться в течение нескольких месяцев. При этом у спортсменов, представляющих разные виды спорта, существенно различаются реакции иммунной системы [42, 92]. Психоэмоциональное напряжение, приводящее к развитию интенсивной стресc–реакции, может приводить к снижению неспецифической естественной защиты. Так, у спортсменов в период интенсивных тренировок снижается число полиморфноядерных лейкоцитов и их способность к фагоцитозу [55], которая обычно стимулируется при умеренных тренировках. При интенсивных тренировках снижается синтез ИЛ–2 и ИФН, что продемонстрировано при вирусной стимуляции лимфоцитов in vitro [62]. Снижается способность к первичному и вторичному иммунному ответу, угнетается индуцированный вирусом синтез ИФН, уменьшается содержание комплемента. Как отмечалось выше, все эти изменения приводят к снижению устойчивости к инфекциям.