цКЮБМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ яКСВЮИМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ
йюрецнпхх:
юБРНЛНАХКХюЯРПНМНЛХЪаХНКНЦХЪцЕНЦПЮТХЪдНЛ Х ЯЮДдПСЦХЕ ЪГШЙХдПСЦНЕхМТНПЛЮРХЙЮхЯРНПХЪйСКЭРСПЮкХРЕПЮРСПЮкНЦХЙЮлЮРЕЛЮРХЙЮлЕДХЖХМЮлЕРЮККСПЦХЪлЕУЮМХЙЮнАПЮГНБЮМХЕнУПЮМЮ РПСДЮоЕДЮЦНЦХЙЮоНКХРХЙЮоПЮБНоЯХУНКНЦХЪпЕКХЦХЪпХРНПХЙЮяНЖХНКНЦХЪяОНПРяРПНХРЕКЭЯРБНрЕУМНКНЦХЪрСПХГЛтХГХЙЮтХКНЯНТХЪтХМЮМЯШуХЛХЪвЕПВЕМХЕщЙНКНЦХЪщЙНМНЛХЙЮщКЕЙРПНМХЙЮ
Sect; 1. кАРТИРОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МЕДИАТОРОВ
|
|
Одним из подходов, используемых для визуализации нейронов, которые высвобождают какие-либо медиаторы в ЦНС, является картирование распределения нейронов с помощью методов гистологии или иммуногистохимии. Флуоресцентный метод Фалька и Хиллярпа1) позволяет метить нейроны, содержащие биогенные амины, такие как дофамин, норадреналин и 5-гидрокситриптамин (5-НТ, известный также как серотонин). После конденсации с формальдегидом каждое из этих веществ при облучении ультрафиолетом начинает испускать свет с характерной длиной волны2) (рис. 14.2). Для небольших молекул нейромедиаторов, таких как ГАМК (g-аминомасляная кислота), 5-НТ, дофамин3) и нейропептиды, были созданы специфичные антитела. Антитела напрямую или через
294 Раздел П. Передача информации в нервной системе
| Рис. 14.2. Визуализация клеток, содержащих биогенные амины, и их терминален с помощью вызванной формальдегидом флюоресценции. (А) Клетки, содержащие норадреналин, в голубом пятне (locus coeruleus) (В) Распределение окончаний клеток голубого пятна в гиппокампе. Fig. 14.2. Visualization of Biogenic Amine-Сопtaining Cells and their terminal arborizations by formaldehydeinduced fluorescence. (A) Norepinephrine-containing cells in the locus coeruleus. (B) The terminal arborizations of locus coeruleus cells in the hippocampus. (From Harik, 1984.) |
промежуточные звенья соединяют с маркерами, которые могут быть обнаружены с использованием световой, флуоресцентной или электронной микроскопии. Методы клонирования кДНК нейропептидов и гибридизации in situ дали дополнительные возможности для идентификации нейронов, которые синтезируют нейропептиды, и для изучения регуляции экспрессии пептидов4).
Альтернативой методам мечения самих медиаторов является создание специфических зондов для обнаружения ферментов, осуществляющих синтез и деградацию медиаторов. Нейроны содержат большое число ферментов, катализирующих синтез тех медиаторов, которые высвобождаются данными нейронами. Например, нейроны, использующие в качестве медиатора ГАМК, имеют высокий уровень фермента декарбоксилазы глутаминовой кислоты. Антитела к этому ферменту были использованы для обнаружения ГАМК-содержащих нейронов5· 6). Антитела к ферменту холинацетилтрансферазе метят холинергические нейроны7), в то время как антитела к тирозингидроксилазе и дофамин-b-гидроксилазе выявляют клетки, высвобождающие дофамин и норадреналин8). Для многих ферментов, участвующих в синтезе нейромедиаторов, была клонирована комплементарная ДНК. Регуляция и локализация мРНК этих ферментов были изучены с использованием метода гибридизации in situ 9). Ферменты, участвующие в распаде медиатора, в меньшей степени подходят для его идентификации. В то же время при определенных условиях ферменты, разрушающие ацетилхолин и ГАМК, могут быть использованы в качестве подходящих маркеров этих медиаторов10)--12).
Химическая природа синапсов может быть также установлена с помощью зондов, распознающих рецепторы на постсинаптических клетках. Например, моноклональные антитела к рецепторам ГАМК были использованы для локализации синапсов, в которых ГАМК, возможно, является медиатором13). С другой стороны, сам медиатор или специфичный агонист или антагонист рецепторов, содержащий радиоактивную метку, может быть использован для обнаружения рецепторов14)--16). Другие методы основаны на механизмах инактивации медиаторов. Например, клетки, которые высвобождают биогенные амины или ГАМК, имеют специфичные системы обратного захвата этих медиаторов. Поэтому при инкубации ткани с радиоактивным норадреналином, дофамином, 5-НТ или ГАМК можно избирательно выделить те нервные терминали, которые высвобождают эти медиаторы.
Быстрое нарастание сведений о генах, кодирующих рецепторы нейромедиаторов, сделало возможным разработку и внедрение экспериментальных стратегий, использующих молекулярно-генетические методы. In situ гибридизация позволяет установить местонахождение мРНК. Полимеразные цепные реакции, осуществляемые обратной транскриптазой (reverse-transcriptase polimerase chain reaction) (RT-PCR) дают возможность амплификации продуктов идентифицированных генов. Эта реакция может быть проведена на небольших фрагментах нервной ткани или даже на единичных изолированных клетках17). Можно также вывести трансгенных животных, у которых необходимый ген, предположительно кодирующий рецептор, удаляют с помощью технологии нокаута (gene " knock
Глава 14. Нейромедиаторы в центральной нервной системе 295
out") или изменяют каким-либо другим способом. Последующее изучение поведения и физиологии таких животных дает информацию о вкладе гена-кандидата в работу синапсов. Эксперименты сходного типа могут быть выполнены и на клетках при введении в них антисенс-олигонуклеотидов в условиях in vitro 18). Наконец, мутации генов, связанных с функциями нейромедиаторов, и имеющие место в естественных условиях у людей или животных, приводят к изменениям поведения, которые позволяют сделать выводы о функциях продуктов, кодируемых этими генами. В случае рецептора для нейромедиатора это могут быть анатомические или функциональные изменения в отделах мозга или даже в отдельных нейронах, чувствительных к этому нейромедиатору.