Генетика цитоплазматических детерминантов у дрозофилы

В 1936 г. эмбриолог Джаст (Just, 1936) критиковал тех генетиков, которые полагали, что объяснить процессы развития можно, изучая мутации, влияющие на окраску глаза, число щетинок и форму крыла. Он говорил, что не интересуется развитием щетинок на спине мухи, а хочет знать, как у зародыша мухи образуется сама спина. Спустя 50 лет эмбриологи и генетики, наконец, ответили на этот вопрос.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОСРЕДСТВОМ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СПЕЦИФИКАЦИИ ___________ 31

Рис. 7.28. Обнаружение первичных половых клеток в энтодерме нейрулы лягушки. Участок ткани из вентральной области зародыша-донора из линии лягушек, в клетках которых имеется только по одному ядрышку (1- nu), пересаживали в аналогичную область зародыша-хозяина из линии лягушек, клетки которых содержат по два ядрышка (2- nu). Взрослое животное, развивавшееся из зародыша-донора. оказывалось стерильным, тогда как зародыш-хозяин развивался в лягушку. у которой имелись гаметы двух типов 1 -пи и 2-пи. Этот факт был подтвержден в опытах по скрещиванию лягушки-хозяина с нормальной (двуядрышковой) особью; результаты такого скрещивания показаны в графической форме в нижней части рисунка. Некоторые из потомков имели только по одному ядрышку в клетках: это свидетельствовало о том. что они получили одно ядрышко от одного из родителей (двуядрышковой линии) и не получили ни одного ядрышка от другого родителя (лягушка двуядрышковой линии с некоторым количеством одноядрышковых половых клеток). (По Blackler, 1966.)

В настоящее время мы располагаем данными о существовании в яйцах двукрылых насекомых трех групп детерминантов. Одну группу составляют факторы, детерминирующие образование полярных и первичных половых клеток, которые уже обсуждались в этой главе. Вторая группа цитоплазматических детерминантов контролирует дорсовентральную полярность, разграничивающую спинную и брюшную области у личинки мухи. Третья группа детерминантов устанавливает переднезаднюю полярность (голова хвост) развивающегося насекомого.

Дорсовентральная полярность. Дорсовентральная полярность у дрозофилы определяется (специфицируется) по меньшей мере 11 продуктами деятельности генома матери, накапливающимися в ооците по мере его развития. Андерсон и Нюсслейн-Вольгард (Anderson, Nü sslein-Volhard, 1984) изолировали 10 генов с материнским эффектом, отсутствие каждого из которых связано с отсутствием вентральных

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

32________________ ГЛАВА 7 _______________________________________________________________________________

Рис. 7.29. Предотвращение развития дефектов у личинки путем инъекции мРНК из яиц дикого типа в яйца, предназначенные иметь фенотип snake. А. Деформированная личинка, состоящая исключительно из дорсальных клеток. Такие личинки развиваются из яиц самок, гомозиготных по аллелю snake Б. Фенотип дикого типа у личинки, развившейся из яйца самки snake, в которое была инъецирована мРНК из яиц дикого типа. (Из Anderson. Nü sslein-Volhard. 1984: фотографии с любезного разрешения С. Nü sslein-Volhard.)

структур. В некоторых случаях материнским продуктом является, по-видимому, белок, тогда как в других случаях самка мухи снабжает яйцо специфической мРНК. Одна из мутаций, связанных с материнским эффектом, называется snake. Самки, гомозиготные по этой мутации, продуцируют яйца, которые развиваются в полностью дорсализованных зародышей. У них отсутствуют кутикула и структуры, типичные для брюшка личинки. Такие зародыши могут быть «исправлены» инъекцией небольшого количества цитоплазмы из яиц дикого типа. Показано, что активный компонент цитоплазмы яйца дикого типа представляет собой накопленную в оогенезе мРНК. поскольку если мРНК экстрагировали из яиц дикого типа и затем инъецировали мутантным зародышам на стадиях раннего дробления, то вентральные структуры и кутикула развивались нормально (рис. 7.29). Таким образом, здесь мы встречаемся с ситуацией, когда в материнском гене закодирована мРНК, необходимая для дорсовентральной спецификации. В отсутствие этого продукта все клетки развиваются в дорсальные структуры, но когда этой мРНК снабжают дефектных зародышей, их нормальное развитие восстанавливается.

Рецессивная мутация Toll имеет сходный дорсализованный фенотип, и инъекция мРНК из яиц дикого типа восстанавливает дорсовентральную полярность яиц, отложенных матерями Toll^–/ Toll^–. Но в отличие от случая snake в данной ситуации имеет значение место инъекции. В какую бы часть яйца ни инъецировали мРНК, эта часть становится вентральной областью «излеченного» зародыша (Anderson et al.. 1985). Это позволяет предположить, что в яйцах Toll^–/ Toll^– отсутствует дорсовентральная полярность (тогда как в случае мутации snake при инъекции мРНК дикого типа вентральная область занимает свое нормальное место). Поэтому представляется вероятным, что продукт дикого типа Toll участвует в установлении этой полярности и действует раньше продукта гена snake (рис. 7.30).

При клонировании аллеля дикого типа snake (DeLotto, Spierer, 1986) было обнаружено, что он кодирует аминокислотную последовательность, сходную с последовательностью протеаз трипсина и фактора свертывания крови. Такие ферменты часто принимают участие в активации неактивных предшественников посредством отщепления аминокислотной последовательности, подавляющей их активность. Этот факт поддерживает предположение Андерсона и Нюсслейн-Вольгард о том, что продукт гена Toll является неактивным белком, который активируется продуктами нормальных аллелей гена snake и других локусов.

По крайней мере один продукт гена, необходимый для установления и поддержания дорсовен-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОСРЕДСТВОМ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СПЕЦИФИКАЦИИ ___________ 33

Рис. 7.30. Связь между местом инъекции мРНК и положением дорсовентральной оси у зародышей Toll–, получивших мРНК из яиц дикого типа. А. Личинка с нормальным положением дорсовентральной оси; у личинки имеются вентральная борозда и связанные с ней структуры. Б. Клетки зародыша Toll– дифференцируются с образованием только дорсального эпидермиса. В-Д. Локализация инъецированной цитоплазмы дикого типа (обозначена черным пятном) определяет положение дорсовентральной оси. (Обратите внимание, однако, что эти структуры никогда не распространяются по всей переднезадней оси.) (По Anderson et al. 1985.)

тральной полярности, должен быть белком. Инъекция цитоплазмы яйца дикого типа корректирует (исправляет) в яйцах дефект, обусловленный материнскими генами, но изолированная из нее мРНК не восстанавливает дорсовентральную полярность.

Что же контролируют эти продукты генов с материнским эффектом? Полагают, что они участвуют в образовании репрессора. который подавляет активацию единичного гена в геноме дрозофилы. Этот ген zerknullt (zen) обычно экспрессируется только в дорсальных структурах, составляющих 40% зародыша, и не бывает активным в вентральных областях. У тех 10 мутантов с материнским эффектом, которые характеризуются дорсализацией зародыша. ген zen экспрессируется и в дорсальных, и в вентральных областях зародыша.

У одного мутант с материнским эффектом (cactus), характеризующегося вентрализацией зародыша, ген zen репрессируется во всем зародыше (рис. 7.31; Rushlow et al.. 1987). Возможно, что нормальные аллели десяти мутантов с материнским эффектом вентрализации включены в процесс образования ингибитора гена zen, тогда как нормальный аллель гена cactus продуцирует репрессор этого ингибитора, способствуя активации гена zen в этой части зародыша.

ПЕРЕДНЕЗАДНЯЯ ПОЛЯРНОСТЬ. Другая группа мутаций с материнским эффектом ответственна за спецификацию переднезадней полярности у личинок насекомых. Один такой аллель носит название bicoid (bcd). У зародышей, происходящих от самок, гомозиготных по гену bicoid. отсутствуют голова и грудные сегменты. Цитоплазма яиц дикого типа (примерно 3% всего объема яйца) может излечить этих дефектных зародышей, но только при том условии, что цитоплазма взята из передней четверти яйца. Более того, место, в которое инъецировали эту цитоплазму, станет затем передним участком тела. Фенотип мутанта bicoid можно получить (фенокопировать), проколов передний конец раннего зародыша дикого типа и позволив вытечь около 5% цитоплазмы (Frohnhö fer. Nü sslein-Volhard. 1986).

Аналогом мутации bicoid в заднем конце, по-видимому, является мутация oskar. У зародышей, развившихся из яиц. отложенных гомозиготными самками oskar, не образуются структуры брюшка или полярные клетки. Результаты опытов по трансплантации (Lehmann. Nü sslein-Volhard. 1986), сходных с теми, которые проведены на мутантах bicoid. показали, что детерминант для oskar находится только в заднем конце яйца дрозофилы дикого типа. Если цитоплазму, взятую из заднего конца зародыша, инъецировать в переднюю область зародыша дикого типа, то формируется вторая задняя область.

Мутации с материнским эффектом caudal (cad) и bicaudal (bic). по-видимому, отвечают на сигналы переднезадней полярности, даваемые мутациями oskar и bicoid. У зародышей, имеющих фенотип caudal, отсутствуют задние абдоминальные структуры, тогда как зародыши bicaudal имеют фенотип «двойного брюшка», выражающийся в том, что два задних зеркально отраженных отдела соединяются по средней линии (рис. 7.32). Таким образом, у зародышей bicaudal большая часть передних сегментов утрачена и замещена дубликатами задних сегментов. У дикого типа caudal мРНК в зародыше на стадии синцитиальной бластодермы распределена по заднепереднему градиенту концентрации. Она транслируется в ядерный белок со сходным градиентом концентрации (рис. 7.33, А). По мере цел-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

34________________ ГЛАВА 7 _____________________________________________________________________

Рис. 7.31. Экспрессия гена zen. А. Экспрессия нормального аллеля zen. обнаруживаемая методом гибридизации in situ с одноцепочечной радиоактивной zen -ДНК на препарате среза через зародыш дикого типа и последующим выявлением радиоактивной метки с использованием фотографической эмульсии. Темные пятна представляют области, в которых радиоактивность ДНК, связанной с мРНК, восстанавливает зерна серебра в фотографической эмульсии. Zen мРНК обнаруживается в дорсальной области зародыша дикого типа. Б. Экспрессия гена zen во всем зародыше у дорсализованного мутанта. В. Отсутствие экспрессии гена zen у вентрализованного мутанта cactus. (Из Rushlow et al., 1987; фотографии с любезного разрешения M. Levine.)

люляризации бластодермы градиент поляризуется, т.е. белок обнаруживается в виде единичного кольца шириной в 3 4 клетки и в полярных клетках (рис. 7.33.5). Следовательно, характер распределения белка в зародыше меняется от градиентного до локализованного в определенной области. Однако эффект мутации bicaudal предшествует действию гена caudal. При окрашивании на присутствие белка caudal в зародышах bicaudal обнаруживаются два феномена. Во-первых, отсутствует градиентное распределение этого белка в синцитиальной бластодерме (рис. 7.33. В), и, во-вторых, локализация белка caudal происходит в двух областях вблизи переднего полюса и вблизи заднего полюса (рис. 7.33. Г). По-видимому, вещество bicaudal ответственно за считывание информации о переднезадней полярности и необходимо для правильного размещения продуктов гена caudal. Продукты этого

Рис. 7.32. Мутанты с нарушением переднезадней полярности. А. Кутикула личинки дикого типа: видны голова, три грудных сегмента (Т1-Т3) и 8 брюшных сегментов (Al A8). Б. Симметричное двойное брюшко, характерное для зародыша, происходящего от самки, гомозиготной по мутации bicaudal, В. Редуцированное брюшко, характерное для зародышей, продуцируемых самками, гомозиготными по мутации caudal. (По Gergen et al., 1986: Macdonald. Struhl, 1986.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОСРЕДСТВОМ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СПЕЦИФИКАЦИИ __________ 35

Рис. 7.33. Экспрессия нормального аллеля белка caudal в зародышах дрозофилы дикого типа и bicaudal. Зародышей фиксировали и окрашивали с помощью иммунологической методики, используя антитела к белку caudal. А. Виден градиент белка caudal в ядрах синцитиальной бластодермы зародыша дикого типа. Б. Градиент белка caudal дикого типа, экспрессированного в ядрах синцитиальной бластодермы зародыша bicaudal. отсутствует. В. Стадия клеточной бластодермы зародыша дикого типа. Видно заднее кольцо белка caudal. Г. В клеточной бластодерме мутанта bicaudal видны два кольца белка caudal (по одному на каждом конце зародыша). Каждый конец становится задней областью. (Из Macdonald, Struhl, 1986.)

гена, по всей вероятности, необходимы для активации генов, специфичных для задних сегментов (Macdonald, Struhl, 1986; Mlodzik, Gehring, 1987).

Сходные мутации были обнаружены у других видов мух (таких, как Smittia), a фенокопии этих мутантов могут быть получены облучением передней области яйца лазерным микролучом или микроинъекцией рибонуклеазы в переднюю область яйца (рис. 7.34; Kandler-Singer. Kalthoff. 1976). Такие облученные яйца можно «излечивать» микроинъекцией мРНК из зародышей дикого типа (Kaltho Elbetiehn. 1986).

Спецификация дорсовентральной и переднезадней полярности осуществляется двумя действующими независимо одна от другой группами детерминантов. Эти морфогенетические детерминанты представляют собой мРНК и белки, запасенные в ооците, а установление и поддержание каждой из осей зародыша осуществляются в результате взаимодействия этих факторов в цитоплазме яйца Эти факторы распределяются по специфическим клеткам и влияют на транскрипцию генов в их ядрах. Процессы, благодаря которым разные сегменты приобретают свою специфику (например, то, что на грудных сегментах образуются ноги, а на брюшных - нет) в соответствии с локализацией их клеток по этим осям, будут подробно рассмотрены в гл. 18. Изучение генетики формирования признаков у дрозофилы может стать «Золотым копьем» генетики развития. В течение десятилетий существовали два больших пробела, препятствующие попыткам объединить генетику и развитие. Первый – отсутствие

Рис. 7.34. Нормальный и облученный зародыши галлицы Smittia. У нормального зародыша (вверху) видны голова слева и брюшные сегменты справа. У облученного зародыша нет области головы, а на обоих концах имеются только брюшные сегменты. (Из Kalthoff, 1969; фотография с любезного разрешения К. Kalthoff.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

36________________ ГЛАВА 7 _______________________________________________________________________________

знаний о молекулах, которые участвуют в спецификации первичных эмбриональных осей. Каким образом задняя часть зародыша становится отличной от его передней части? Второй пробел в наших знаниях касается взаимодействия цитоплазматических детерминантов с ядрами клеток, содержащих эти детерминанты. Гены, ответственные за эти процессы, теперь известны, а некоторые из генных продуктов идентифицированы. В течение короткого времени мы сумеем объяснить, каким образом цитоплазматические детерминанты определяют судьбу клеток зародыша.

РЕЗЮМЕ

В настоящее время мы распознаем данными о том, что у некоторых организмов судьба любой клетки определяется той частью цитоплазмы, которую она приобретает в процессе дробления. Такая клетка дифференцируется независимо от других клеток, а организмы, использующие этот механизм. имеют тенденцию идти по пути мозаичного, или детерминированного, развития. Этот тип развития характерен для зародышей моллюсков, оболочников и нематод. Локализация морфогенов в цитоплазме яйца, их перераспределение в процессе развития яйца и оплодотворения, а также характер дробления имеют важное значение для детерминации судьбы каждой клетки. Любое из этих событий является функцией яйца. Развитие этих организмов в основном протекает по мозаичному типу, однако у них обнаруживаются и некоторые детерминирующие взаимодействия. У оболочников нервная система и некоторые из мышц формируются в результате индукционных взаимодействий между бластомерами: таким же способом образуются некоторые органы у улиток и нематод В следующей главе мы рассмотрим развитие организмов, у которых индукционные взаимодействия составляют основной механизм детерминации судьбы клеток.

ЛИТЕРАТУРА

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОСРЕДСТВОМ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СПЕЦИФИКАЦИИ _____________ 37

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

38 ГЛАВА 7

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.